mechanizmy molekularne, które mogą przyczynić się do przedłużonej skuteczności inhibitorów PDE5 w celu poprawy erekcji

według wszystkich opinii skuteczność działania syldenafilu, wardenafilu lub tadalafilu w celu zwiększenia odpowiedzi na erekcję wydaje się dobrze porównywać. Czas (Tmax) wymagany do osiągnięcia maksymalnego stężenia w osoczu (Cmax) i czas rozpoczęcia działania różnią się nieznacznie, przy czym tadalafil jest nieco wolniejszy niż syldenafil lub wardenafil. Jednak leki różnią się znacznie pod względem szybkości klirensu z osocza; T1 / 2 klirensu osoczowego wynosi ∼4 godziny dla syldenafilu lub wardenafilu w porównaniu do 18 godzin dla tadalafilu. Działanie syldenafilu lub wardenafilu u mężczyzn jest optymalne przy

uważa się, że czas działania leku jest ściśle skorelowany z poziomem leku w osoczu. Zgodnie z tym modelem klirens leku z osocza, wyjście leku z tkanki i zaprzestanie działania leku w tej tkance zasadniczo pokrywałyby się. Jednak długotrwałe działanie silnych inhibitorów PDE5 nie pasuje do tego modelu. Kilka mechanizmów biochemicznych może wyjaśniać pozornie przedłużające się działanie inhibitorów PDE5. (1) Jeśli inhibitor jest usuwany z tkanki równolegle z jego usuwaniem z osocza, to utrzymywanie się jego skutków biologicznych musi wynikać z uprzedniej ekspozycji tkanki na inhibitor, być może w połączeniu z trwałą aktywacją szlaku sygnałowego cGMP w czasie ekspozycji (to jest „pamięć komórkowa” doświadczenia sygnałowego cGMP). Ponadto, jeśli lek zostanie usunięty z komórki, aktywność PDE5 zostanie przywrócona, a poziom cGMP będzie zbliżony do poziomu podstawowego (Fig. (2) alternatywnie, jeśli lek nie jest usuwany równolegle z usuwaniem z osocza, to znaczy lek jest zatrzymywany (lub sekwestrowany) w VSMC ciał jamistych i rozkład cGMP przez PDE5 pozostaje w dużej mierze zablokowany (Fig.2b), niski poziom innych hydrolizujących cGMP PDE obecnych w tych komórkach może nieco obniżyć cGMP. Sprzyjałoby to (1) trwałemu wiązaniu cGMP z allosterycznymi miejscami wiązania cGMP w PDE5 w celu zwiększenia powinowactwa do inhibitorów, (2) trwałemu wiązaniu cGMP z PKG i aktywacji szlaku sygnałowego cGMP oraz (3) zwiększonemu komórkowemu cGMP, który nie jest łatwo hydrolizowany. W tym ostatnim scenariuszu stężenia komórkowe inhibitora PDE5 i cGMP byłyby podwyższone do pewnego stopnia, co wynikałoby ze specyficznej sekwestracji każdego z tych ligandów, to znaczy inhibitora ściśle związanego z miejscem katalitycznym PDE5 i cGMP ściśle związanego z allosterycznymi miejscami wiązania cGMP w PKG i PDE5. Powyższe możliwe wyjaśnienia przedłużającego się wpływu inhibitorów PDE5 na odpowiedź na erekcję będą brane pod uwagę. Hipotezy te opierają się na ustalonych mechanizmach molekularnych, o których wiadomo, że są związane z PDE5 i PKG, chociaż rozważania nie wykluczają innych mechanizmów.

uporczywe konsekwencje aktywacji szlaku sygnałowego cGMP

w pierwszej kolejności należy rozważyć możliwość wystąpienia efektu „pamięci” po ekspozycji tkanek na inhibitory PDE5, z jednoczesnym lub bez jednoczesnego zwiększenia cGMP. Zwykle, podniesienie cGMP i aktywacja PKG wprawiają w ruch kaskadę zdarzeń komórkowych, a działanie PDE5 przeciwdziała temu efektowi poprzez hydrolizę nukleotydu. W badanych tkankach dowody sugerują, że działanie PDEs odpowiada za większą część zdolności komórki do zmniejszania cyklicznych poziomów nukleotydów.32, 33 obecność inhibitorów PDE5 blokuje działanie PDE5 i zwiększa kumulację cGMP i sygnalizację cGMP. Nie wiadomo, czy poziom cGMP osiągnięty w obecności inhibitorów PDE5 jest podobny do poziomu występującego w warunkach fizjologicznych lub czy cGMP kumuluje się do znacznie wyższego poziomu. W mięśniach gładkich tętnicy wieńcowej świń trzykrotne podniesienie cGMP powoduje maksymalne rozluźnienie.PDE5 jest głównym PDE hydrolizującym cGMP w ciałach jamistych8, tak więc dopóki obecne są inhibitory PDE5, istnieje prawdopodobieństwo, że znaczny poziom cGMP utrzyma się w tej tkance nawet po ustąpieniu erekcji z powodu innych czynników. Jeśli tak, PKG prawdopodobnie pozostanie aktywowany do pewnego stopnia przez kilka godzin.

długi czas zwiększonego działania PKG opisanego powyżej może wywoływać skutki nie występujące w większości okoliczności fizjologicznych, ponieważ przewiduje się, że działanie PDE5 przy braku inhibitorów szybko powróci do cGMP i aktywności PKG do poziomu bliskiego podstawnemu. Ogólnie uważa się, że efekty reakcji fosforylacji za pośrednictwem PKG są szybko równoważone przez działanie fosfataz fosfoproteinowych. Nawet w obliczu spadku cGMP i zmniejszonej aktywności PKG, odwrócenie efektów fosforylacji PKG może różnić się między fosfoproteinami; niektóre mogą być szybko defosforylowane i przywrócone do pierwotnego stanu czynnościowego, inne mogą być chronione przed szybką defosforylacją przez ich lokalizację w komórce lub przez skompleksowanie z innymi białkami, podtrzymując w ten sposób pierwotny efekt zwiększonego cGMP. W rzeczywistości niewiele wiadomo o prawdziwych konsekwencjach i kursach czasowych działania którejkolwiek z tych ścieżek. Jeśli aktywacja PKG i / lub efekty fosforylacji mediowanych przez PKG nie zostaną w pełni odwrócone w odpowiednim czasie (Fig.2a), kolejne podniesienie cGMP przez bodźce erotyczne może spowodować podwyższoną odpowiedź erekcyjną nawet przy braku inhibitorów PDE5. Przedłużony wpływ zdarzeń fosforylacji na funkcję białek komórkowych może wystąpić przez szereg mechanizmów, w tym (1) przedłużoną fosforylację białek docelowych w komórce, być może z powodu powolnej defosforylacji przez fosfatazy fosfoproteinowe, (2) zmiany strukturalne, takie jak konwersja między formami o różnych poziomach aktywności, (3) zmiany poziomów białek spowodowane zmianą ekspresji genów, translacją mRNA i/lub stabilnością i / lub szybkością obrotu białek, (4) translokację białek między przedziałami komórkowymi i (5) zwiększoną wrażliwość na cGMP i/lub metabolizm białek. szlak sygnałowy cGMP. Fosforylacja PDE5 za pośrednictwem PKG powoduje widoczną zmianę konformacyjną enzymu i zwiększa powinowactwo do cGMP w miejscach allosterycznych i do inhibitorów/cGMP w miejscu katalitycznym.11, 35, 36, 37 cykliczny PKG aktywowany GMP ulega autofosforylacji, co nieznacznie podnosi aktywność enzymu nawet przy braku cGMP i zwiększa jego wrażliwość na kolejne wzrosty cGMP (Fig.3).38, 39, 40, 41 Autofosforylacja powoduje również pozorną zmianę konformacyjną enzymu i promuje większe powinowactwo do wiązania cGMP w porównaniu z unfosfo-PKG, tym samym zatrzymując cGMP w allosterycznych miejscach wiązania cGMP; 38, 42 ponieważ allosteryczne miejsca wiązania cGMP PKG są dodatnio kooperatywne,43 miałoby to tendencję do „prime” PKG do pełnej aktywacji przez późniejszy niewielki wzrost cGMP. Niektóre białka, które zostały fosforylowane przez PKG, mogą być następnie kowalencyjnie modyfikowane przez inne modyfikacje posttranslacyjne, takie jak utlenianie, ubikwitynacja lub fosforylacja przez inne kinazy, które mogłyby przedłużyć lub w inny sposób wpłynąć na konsekwencje sygnalizacji cGMP.

zmiany poziomu białek będących substratami dla PKG mogą następować w wyniku licznych procesów. Fosforylacja za pośrednictwem PKG celuje w czynniki transkrypcyjne, które regulują ekspresję genów, 44, 45, które mogą zmieniać poziomy białek poniżej PKG. W innych przypadkach, phosphorylation może cel proteiny dla rozpadu przez ubikwitynation szlak.46, 47 cykliczna aktywacja GMP PKG w niektórych komórkach powoduje translokację enzymu z cytozolu do specyficznych lokalizacji subkomórkowych i fosforylację białek docelowych w obrębie tego przedziału.Wykazano również, że aktywacja PKG powoduje redystrybucję niektórych białek, na przykład RhoA, 51 w komórce lub wstawianie białek do błon,zmieniając w ten sposób funkcję.52, 53 niektóre procesy komórkowe wpływające na aktywność PKG, na przykład zmiany w polimeryzacji białek fibrylarnych lub wstawianiu białek do błon mogą być powolne do odwrócenia. Są to ważne względy przy stosowaniu schematów farmakologicznych, które sprzyjają podwyższeniu cGMP i które mogą być utrzymywane przez kilka godzin, a nawet dni, jeśli osoba jest przewlekle leczona. Konsekwencje krótkoterminowych zmian w aktywności szlaku sygnałowego cGMP mogą znacznie różnić się od skutków bardziej trwałej aktywacji i wymagają dokładnego zbadania.

zatrzymanie inhibitorów PDE5 w VSMC po usunięciu z osocza

prawdopodobieństwo, że inhibitory PDE5 mogą być zatrzymane w VSMC i sprzyjać poprawie odpowiedzi erekcji, nawet po usunięciu z osocza, jest również prawdopodobne (Fig.2b i 4). Syldenafil, wardenafil i tadalafil nie są metabolizowane w VSMC; aby odwrócić działanie tych leków w tkankach, leki muszą dysocjować z PDE5, dyfundować przez cytozol do błony osocza, przemierzać błonę osocza i być transportowane do wątroby w celu modyfikacji i usunięcia przez działanie cytochromów. Leki takie jak te, które mają stosunkowo krótki okres półtrwania w osoczu, wiążą się z wysokim powinowactwem do wewnątrzkomórkowych receptorów, takich jak PDE5, ale nie są degradowane w komórce docelowej, należą do nieco unikalnej klasy, która nie była szeroko badana. Nieprzewidziane Właściwości farmakokinetyczne komórek, które wpływają na klirens komórkowy, mogą mieć zastosowanie do tych leków.

oczekuje się, że poziom PDE5 wpłynie na wejście i akumulację inhibitorów PDE5 w komórkach. W związku z tym przewiduje się, że komórki, które są bogate w PDE5, selektywnie nabywają i zatrzymują inhibitor w porównaniu z komórkami z niewielkim lub żadnym PDE5 (Fig.4a–c). Po wchłonięciu leków do krwiobiegu inhibitor jest transportowany na powierzchnię VSMC przez krążenie ogólnoustrojowe. Początkowo brak leku w cytozolu tworzy duży gradient chemiczny dla związku między zewnętrzną i wewnętrzną częścią komórki; ułatwiłoby to wprowadzanie leku do komórki (Fig.4a). Ponieważ inhibitory są związane z bardzo wysokim powinowactwem do PDE5, przewiduje się, że gdy tylko inhibitor wejdzie do komórki, prawie natychmiast zostanie związany przez PDE5, to znaczy w dużej mierze odizolowany od cytozolu, a wolny inhibitor w cytozolu pozostanie bardzo niski, utrzymując w ten sposób gradient. Wiązanie inhibitora z PDE5 zwiększy szybkość gromadzenia się inhibitorów, ponieważ po napływie inhibitora do komórek należy spowolnić wypływ inhibitora komórkowego ze względu na małą ilość wolnego inhibitora w cytozolu (Fig.4a). Ponadto znaczna część cząsteczek inhibitora, które dysocjują z PDE5, prawdopodobnie ponownie połączyłaby się z enzymem przed opuszczeniem komórki. Czynniki te ułatwiłyby gromadzenie inhibitora w komórce proporcjonalnie do poziomu komórkowego PDE5. Zgodnie z tym modelem nagromadzenie inhibitora w komórce byłoby wysycalne i oznaczałoby stężenie wewnątrzkomórkowego PDE5. Gdy wszystkie miejsca katalityczne PDE5 są wypełnione (nasycone), stężenie wolnego inhibitora w cytozolu w końcu zbliżyłoby się do stężenia w osoczu (Fig.4b), ale całkowity inhibitor w komórce miałby znaczący wpływ na poziom PDE5 w tej komórce, tak że całkowity inhibitor w komórce=inhibitor związany z wolnym inhibitorem PDE5+w cytozolu. Przewiduje się również, że długotrwałe działanie komercjalizowanych inhibitorów PDE5 u niektórych pacjentów wynika z tych samych procesów, to znaczy łącznego działania (1) wysokiego poziomu PDE5 w VSMC i (2) wysokiego powinowactwa PDE5 do tych inhibitorów. Podstawowe powinowactwo PDE5 do inhibitorów, które jest samoistnie wysokie (KD=0,1-4 nM), może dalej wzrastać w odpowiedzi na podwyższenie cGMP, jak miałoby to miejsce w przypadku stymulacji seksualnej12 i (lub) przedłużonego narażenia na odpowiednie leki.Jak omówiono poniżej, to zwiększone powinowactwo jest spowodowane wiązaniem allosterycznym cGMP z PDE5, zwiększoną fosforylacją enzymu i przedłużonym zaburzeniem miejsca katalitycznego enzymu przez podwyższone cGMP i inhibitor.9, 11, 12, 55 dlatego kilka godzin po spożyciu inhibitora PDE5, w obecności lub bez pobudzenia seksualnego, stężenie inhibitora w osoczu byłoby wysokie i przewiduje się, że miejsce katalityczne PDE5 w VSMC byłoby nasycone inhibitorem i że powinowactwo PDE5 do inhibitora byłoby znacznie większe niż w stanie podstawowym (Fig.4B). To Wiązanie o wyższym powinowactwie sprzyjałoby ciągłemu wiązaniu inhibitora z PDE5 i zatrzymywaniu inhibitora w VSMC.

najprościej rzecz ujmując, 56, 57 VSMC można uznać za podobne do worków dializacyjnych zawierających zarówno niezwiązane, jak i związane z PDE5 inhibitory. W miarę zmniejszania się inhibitora osocza, można oczekiwać, że wolny inhibitor w cytozolu komórki zmniejszy się równolegle. Jednakże populacja cząsteczek inhibitora związanych w kompleksie inhibitora PDE5 może zmniejszać się wolniej (Fig. 4c i 5), ponieważ Ucieczka inhibitora z komórki nie zależy wyłącznie od szybkości dyfuzji tej cząsteczki przez błonę do osocza. Raczej cząsteczki PDE5 mogą znacząco zakłócać wyjście inhibitora. Inhibitory są odwracalnie związane z PDE5 tak, że kompleks znajduje się w dynamicznej równowadze, to znaczy inhibitor stale dysocjuje z enzymem z określoną szybkością (koff) i odbija się z pewną szybkością (kon) (Fig. 5). Stosunek koff do kon (zwany KD) odzwierciedla powinowactwo enzymu do inhibitora. W przypadku inhibitorów o wysokim powinowactwie związek z PDE5 jest preferowany w tej równowadze, tak że znaczna część inhibitora szybko się rebinuje po dysocjacji z enzymu. Wysokie stężenie PDE5 sprzyjałoby również ponownemu wzmacnianiu inhibitora, ponieważ na szybkość wiązania inhibitora wpływa stężenie zarówno inhibitora, jak i PDE5.

ponieważ część inhibitora wydostaje się z komórki i jest usuwana z jej otoczenia przez krążenie, pojawiłyby się „otwarte” miejsca katalityczne PDE5, tak że nie tylko nastąpiłoby ponowne przyłączenie inhibitora z tym samym PDE5, ale także inne cząsteczki PDE5 byłyby dostępne do przechwycenia i związania inhibitora (Fig.5), co dodatkowo utrudniałoby ucieczkę z komórki. Dlatego cząsteczka inhibitora miałaby znacznie większe prawdopodobieństwo ponownego przejścia do wolnych miejsc na PDE5 niż opuszczenia komórki. Taki scenariusz dysocjacji i ponownego skojarzenia leku dla PDE5 może potencjalnie wystąpić wiele razy, zanim zostanie osiągnięty klirens leku z cytozolu. Może to skutkować stężeniem i zatrzymaniem lub „zatrzymaniem” leku w VSMC, wydłużając w ten sposób czas działania.

wpływ tych procesów na spowolnienie t½ wypływu inhibitora z VSMC można określić ilościowo, biorąc pod uwagę stężenie PDE5 w komórkach wraz z powinowactwem PDE5 do inhibitora. Wpływ PDE5 na powolne wyjście inhibitora z komórki byłby proporcjonalny do 1 + P / KD, gdzie P oznacza stężenie miejsc wiążących inhibitor na PDE5 (stężenie podjednostki PDE5), a KD jest stałą dysocjacji równowagi kompleksu PDE5-inhibitor.Zakładając,że PDE5 wynosi ∼5 × 10-7 M W vsmc8 (niepublikowane Dane) i że KD niefosforylowanego PDE5 dla wardenafilu wynosi 4 × 10-10 M, 12 wewnątrzkomórkowe Wiązanie inhibitora z PDE5 zmniejszyłoby szybkość wypływu tego inhibitora o czynnik∼1500 w porównaniu z szybkością wypływu w komórkach bez PDE5. Czynnik ten wynosiłby >1500, jeśli powinowactwo miejsca katalitycznego PDE5 do inhibitorów, takich jak wardenafil, uległoby zwiększeniu w wyniku zdarzeń komórkowych, takich jak Wiązanie cGMP z allosterycznymi miejscami PDE5, fosforylacja PDE5, przedłużona ekspozycja białka na inhibitor lub inne procesy.

podczas gdy PDE5 ma samoistnie wysokie powinowactwo do syldenafilu, wardenafilu i tadalafilu, wykazano, że modyfikacje białka dodatkowo zwiększają powinowactwo do niektórych lub wszystkich tych inhibitorów, tworząc wiązanie o bardzo wysokim powinowactwie (ryc. 6); obejmują one Wiązanie cGMP z miejscami allosterycznymi PDE5 i miejscem katalitycznym, fosforylację enzymu przez PKG, co jest ułatwione przez wiązanie inhibitora z miejscem katalitycznym PDE5 lub Wiązanie cGMP z miejscami allosterycznymi na PDE5, ekspozycję enzymu na inhibitor przez kilka godzin lub połączenie tych efektów.9, 11, 12, 13, 35, 55 ponieważ Wiązanie cGMP z allosterycznymi miejscami wiązania cGMP na PDE5 i PKG jest również wspierane w tych okolicznościach i chronione przed rozpadem,58, 59 sekwestracja cGMP w tych miejscach spowodowałaby wyższe stężenie komórkowe cGMP w porównaniu do stanu podstawowego i mogłaby zapewnić rezerwuar cGMP do późniejszego uwalniania, zmieniając w ten sposób wydajność wynikającą z późniejszego niewielkiego wzrostu drugiego sygnału komunikacyjnego.60