meccanismi Molecolari che potrebbero contribuire a una prolungata efficacia di inibitori della PDE5 per migliorare la funzione erettile

Da tutti i conti, l’efficacia dell’azione del sildenafil, tadalafil e vardenafil per migliorare la risposta erettile sembra confrontare bene. Il tempo (Tmax) necessario per raggiungere la massima concentrazione plasmatica (Cmax) e il tempo di inizio dell ‘ azione variano leggermente con il tadalafil che è leggermente più lento del sildenafil o del vardenafil. Tuttavia, i farmaci differiscono sostanzialmente nel tasso di clearance dal plasma; t½ di clearance plasmatica è h 4 h per sildenafil o vardenafil rispetto a 18 h per tadalafil. Effetto di sildenafil o vardenafil negli uomini è ottimale a 0 0.5-1 h, che si avvicina il tempo di concentrazione plasmatica di picco (Cmax). La concentrazione plasmatica di questi farmaci diminuisce con t½ di ∼4-5 h in modo che il livello plasmatico del farmaco sia basso dopo 12 h (∼13% di Cmax). Tuttavia, gli studi indicano che gli uomini hanno ancora facilitato le erezioni 12 h dopo la somministrazione.20, 30, 31 Allo stesso modo, i pazienti che hanno assunto tadalafil, che ha un t½ di h 18 h, hanno riportato una migliore funzione erettile a 36 h quando la concentrazione plasmatica del farmaco sarebbe 2 25% di Cmax.17 L’efficacia prolungata di questi farmaci aggiunge flessibilità all’inizio dell’attività sessuale per i pazienti con ED e potrebbe ridurre la frequenza di dosaggio. Se questo schema si applica ad altri tessuti (ad esempio, la vascolarizzazione polmonare), potrebbe significare che regimi di dosaggio meno frequenti potrebbero essere utilizzati per raggiungere l’obiettivo terapeutico desiderato. Ciò potrebbe comportare una minore esposizione del paziente ai farmaci e risparmi sui costi per la terapia.

Si pensa generalmente che il corso temporale dell’azione del farmaco sia strettamente correlato al livello plasmatico del farmaco. Secondo questo modello, la clearance di un farmaco dal plasma, l’uscita del farmaco dal tessuto e la cessazione dell’azione del farmaco in quel tessuto coinciderebbero essenzialmente. Tuttavia, l’azione prolungata di potenti inibitori della PDE5 non si adatta bene a questo modello. Diversi meccanismi biochimici potrebbero spiegare l’effetto apparentemente prolungato degli inibitori della PDE5. (1) Se l’inibitore viene eliminato dal tessuto in parallelo con la sua clearance dal plasma, allora la persistenza dei suoi effetti biologici deve essere dovuta alla precedente esposizione del tessuto all’inibitore, forse in combinazione con l’attivazione persistente della via di segnalazione cGMP durante il periodo di esposizione (cioè la “memoria” cellulare dell’esperienza di segnalazione cGMP). Inoltre, se il farmaco è stato eliminato dalla cellula, l’attività della PDE5 sarebbe ripristinata e il livello di cGMP sarebbe previsto vicino al livello basale (Figura 2a). (2) In alternativa, se il farmaco non viene eliminato in parallelo con la clearance dal plasma, cioè il farmaco viene trattenuto (o sequestrato) nel VSMC del corpo cavernoso e la ripartizione del cGMP da parte della PDE5 rimane in gran parte bloccata (Figura 2b), un basso livello di altre PDE di idrolisi del cGMP presenti in queste cellule potrebbe abbassare leggermente il cGMP. Ciò favorirebbe (1) il legame prolungato del cGMP ai siti di legame allosterico del cGMP sulla PDE5 per aumentare l’affinità per gli inibitori, (2) il legame prolungato del cGMP al PKG e l’attivazione della via di segnalazione del cGMP e (3) l’aumento del cGMP cellulare che non è prontamente idrolizzato. In quest’ultimo scenario, le concentrazioni cellulari di inibitore della PDE5 e cGMP sarebbero elevate in una certa misura, il che deriverebbe dal sequestro specifico di ciascuno di questi ligandi, cioè dall’inibitore legato strettamente al sito catalitico della PDE5 e dal cGMP legato strettamente ai siti di legame allosterico del cGMP in PKG e PDE5. Queste possibili spiegazioni per effetti prolungati degli inibitori della PDE5 sulla risposta erettile saranno considerate qui. Queste ipotesi si basano su meccanismi molecolari consolidati noti per essere associati a PDE5 e PKG sebbene le considerazioni non escludano altri meccanismi.

Conseguenze persistenti dell’attivazione della via di segnalazione del cGMP

Si prenderà in primo luogo in considerazione la possibilità di un effetto “memoria” a seguito dell’esposizione del tessuto agli inibitori della PDE5 con o senza concomitante innalzamento del cGMP. Normalmente, l’elevazione del cGMP e l’attivazione del PKG mettono in moto una cascata di eventi cellulari e l’azione della PDE5 contrasta questo effetto idrolizzando il nucleotide. Nei tessuti che sono stati studiati, l’evidenza suggerisce che l’azione dei PDE rappresenta la maggior parte della capacità della cellula di ridurre i livelli di nucleotidi ciclici.32, 33 La presenza di inibitori PDE5 blocca l’azione di PDE5 e migliora l’accumulo di cGMP e la segnalazione di cGMP. Non è noto se il livello di cGMP raggiunto in presenza di inibitori della PDE5 sia simile a quello che si verifica in condizioni fisiologiche o se il cGMP si accumuli ad un livello molto più alto. Nei muscoli lisci dell’arteria coronaria suina, una triplice elevazione di cGMP produce il massimo rilassamento.34 La PDE5 è la principale PDE di idrolizzazione del cGMP nei corpi cavernosi8, pertanto, finché sono presenti inibitori della PDE5, è probabile che un livello significativo di cGMP persista in questo tessuto anche dopo che l’erezione si è attenuata a causa di altre influenze. In tal caso, è probabile che PKG rimanga attivato in una certa misura per diverse ore.

La lunga durata dell’azione aumentata di PKG descritta sopra potrebbe suscitare effetti non sperimentati nella maggior parte delle circostanze fisiologiche poiché si prevede che l’azione della PDE5 in assenza di inibitori restituisca rapidamente cGMP e l’attività di PKG a livello basale vicino. Gli effetti delle reazioni di fosforilazione mediate dal PKG sono generalmente considerati rapidamente controbilanciati dall’azione delle fosfoproteine fosfatasi. Anche di fronte al declino del cGMP e alla diminuzione dell’attività del PKG, l’inversione degli effetti delle fosforilazioni del PKG può differire tra le fosfoproteine; alcune possono essere rapidamente defosforilate e restituite al loro stato funzionale originale, altre possono essere protette contro la rapida defosforilazione dalla loro posizione nella cellula o complessate con altre proteine, sostenendo così l’effetto originale di un aumento del cGMP. In effetti, si sa poco delle vere conseguenze e dei corsi temporali dell’azione di uno di questi percorsi. Se l’attivazione di PKG e / o gli effetti delle fosforilazioni mediate da PKG non sono completamente invertiti in modo tempestivo (Figura 2a), la successiva elevazione di cGMP da stimoli erotici può produrre una risposta erettile aumentata anche in assenza di inibitori della PDE5. Un prolungato effetto di eventi di fosforilazione su cellulare la funzione della proteina potrebbe verificarsi da una serie di meccanismi, tra cui (1) prolungato la fosforilazione di proteine bersaglio, in cella, forse a causa del lento defosforilazione da fosfoproteina fosfatasi (2) cambiamenti strutturali quali la conversione tra i moduli che hanno diversi livelli di attività, (3) alterazioni nei livelli di proteina a causa di alterazioni nell’espressione genica, la traduzione di mRNA e/o la stabilità, e/o di proteine tasso di turnover, (4) la traslocazione di proteine tra compartimenti cellulari e (5) aumento della sensibilità al cGMP e/o il cGMP-via di segnalazione. La fosforilazione della PDE5 mediata da PKG produce un apparente cambiamento conformazionale nell’enzima e aumenta l’affinità per il cGMP nei suoi siti allosterici e per gli inibitori/cGMP nel suo sito catalitico.11, 35, 36, 37 PKG ciclico attivato da GMP subisce autofosforilazione, che eleva leggermente l’attività dell’enzima anche in assenza di cGMP e aumenta la sua sensibilità ai successivi aumenti di cGMP (Figura 3).38, 39, 40, 41 Autophosphorylation provoca anche un apparente cambiamento conformazionale dell’enzima e favorisce un maggiore affinità per il cGMP vincolante rispetto a unphospho-PKG, in modo da mantenere il cGMP a allosterico cGMP-siti di legame;38, 42, poiché il cGMP-associazione siti allosterici di PKG sono positivamente cooperativa,43 questo tenderebbe a ‘prime’ PKG per la piena attivazione di un successivo piccolo aumento di cGMP. Alcune proteine che sono state fosforilate da PKG possono successivamente essere modificate covalentemente da altre modifiche post-traduttive come l’ossidazione, l’ubiquitinazione o la fosforilazione da altre chinasi che potrebbero prolungare o altrimenti influire sulle conseguenze della segnalazione cGMP.

Cambiamenti nel livello di proteine che sono substrati per PKG potrebbero verificarsi da numerosi processi. La fosforilazione mediata da PKG mira ai fattori di trascrizione che regolano l’espressione genica,44, 45 che potrebbero alterare i livelli di proteine a valle del PKG. In altri casi, la fosforilazione può indirizzare le proteine per ripartizione via la via di ubiquitinazione.46, 47 L’attivazione ciclica di GMP di PKG in alcune celle suscita la traslocazione dell’enzima dal citosol alle posizioni subcellulari specifiche e la fosforilazione delle proteine dell’obiettivo all’interno di quel compartimento.44, 45, 48, 49, 50 L’attivazione di PKG ha anche dimostrato di suscitare la ridistribuzione di alcune proteine, ad esempio RhoA,51 all’interno della cellula o l’inserimento di proteine nelle membrane alterando così la funzione.52, 53 Alcuni processi cellulari influenzati dall’attività del PKG, ad esempio, i cambiamenti nella polimerizzazione delle proteine fibrillari o l’inserimento di proteine nelle membrane possono essere lenti da invertire. Queste sono considerazioni importanti quando si applicano regimi farmacologici che favoriscono l’innalzamento del cGMP e che possono essere sostenuti per diverse ore o addirittura giorni se l’individuo è cronicamente medicato. Le conseguenze dei cambiamenti a breve termine nell’attività della via di segnalazione cGMP possono differire significativamente da quella di un’attivazione più sostenuta e richiedere un’attenta indagine.

Mantenimento degli inibitori della PDE5 nel VSMC dopo la clearance dal plasma

È plausibile anche la possibilità che gli inibitori della PDE5 possano essere trattenuti nel VSMC e promuovere una migliore risposta erettile anche dopo la loro eliminazione dal plasma (Figure 2b e 4). Sildenafil, vardenafil e tadalafil non sono metabolizzati nel VSMC; per l’inversione dell’effetto di questi farmaci nel tessuto, i farmaci devono dissociarsi dalla PDE5, diffondersi attraverso il citosol alla membrana plasmatica, attraversare la membrana plasmatica ed essere trasportati al fegato per la modifica e la clearance dall’azione dei citocromi. Farmaci come questi che hanno emivita plasmatica relativamente breve, si legano con alta affinità ai recettori intracellulari come PDE5, ma non sono degradati nella cellula bersaglio, sono in una classe un po ‘ unica che non è stata studiata estesamente. Caratteristiche farmacocinetiche cellulari impreviste che influenzano la clearance cellulare possono applicarsi a questi farmaci.

Ci si aspetta che l’ingresso e l’accumulo di inibitori della PDE5 nelle cellule siano influenzati dal livello di PDE5. Di conseguenza, si prevede che le cellule che sono abbondanti in PDE5 acquisiscano e trattengano selettivamente l’inibitore rispetto alle cellule con PDE5 scarsa o assente (Figure 4a–c). Dopo l’assorbimento dei farmaci nel flusso sanguigno, l’inibitore viene trasportato alla superficie VSMC dalla circolazione sistemica. Inizialmente, l’assenza del farmaco nel citosol crea un grande gradiente chimico per il composto tra l’esterno e l’interno della cellula; ciò faciliterebbe l’ingresso del farmaco nella cellula (Figura 4a). Poiché gli inibitori sono legati con affinità molto alta a PDE5, si prevede che non appena un inibitore entra nella cellula, sarà quasi istantaneamente legato da PDE5, cioè in gran parte sequestrato dal citosol, e l’inibitore libero nel citosol rimarrà molto basso, mantenendo così il gradiente. Il legame dell’inibitore con la PDE5 aumenterà il tasso di accumulo degli inibitori poiché, a seguito dell’afflusso dell’inibitore nelle cellule, l’efflusso dell’inibitore cellulare dovrebbe essere rallentato a causa della bassa quantità di inibitore libero nel citosol (Figura 4a). Inoltre, una parte significativa delle molecole inibitrici che si dissociano dalla PDE5 probabilmente si riconnetterebbe all’enzima prima di lasciare la cellula. Questi fattori faciliterebbero l’accumulo di inibitore nella cellula commisurato al livello cellulare di PDE5. Secondo questo modello, l’accumulo di inibitore nella cellula sarebbe saturabile e determinato dalla concentrazione di PDE5 intracellulare. Quando tutti i siti catalitici PDE5 sono riempiti (saturi), la concentrazione di inibitore libero nel citosol alla fine si avvicinerebbe a quella nel plasma (Figura 4b), ma l’inibitore totale nella cellula sarebbe significativamente influenzato dal livello di PDE5 in quella cellula in modo che l’inibitore totale nella cellula=inibitore legato all’inibitore libero PDE5+nel citosol. Si prevede inoltre che l’azione prolungata degli inibitori della PDE5 commercializzati riportata in alcuni pazienti derivi dagli stessi processi, ovvero dagli effetti combinati di (1) alto livello di PDE5 in VSMC e (2) alta affinità della PDE5 per questi inibitori. L’affinità basale della PDE5 per gli inibitori, che è intrinsecamente elevata (KD=0,1–4 nM), può aumentare ulteriormente in risposta all’innalzamento del cGMP come si verificherebbe con la stimolazione sessuale12 e/o l’esposizione prolungata ai rispettivi farmaci.Come discusso di seguito, questa aumentata affinità è causata dal legame allosterico del cGMP con la PDE5, dall ‘aumento della fosforilazione dell’ enzima e dalla prolungata perturbazione del sito catalitico dell ‘ enzima da parte di cGMP e inibitore elevati.9, 11, 12, 55, Dunque, poche ore dopo l’ingestione di un inibitore della PDE5 in presenza o assenza di eccitazione sessuale, plasma concentrazione di inibitore vorresti essere alta e si prevede che il sito catalitico della PDE5 in VSMC sarebbe saturi con inibitore e che l’affinità della PDE5 per l’inibitore potrebbe essere significativamente superiore nello stato basale (Figura 4b). Questo legame ad affinità più elevata favorirebbe la continua associazione dell’inibitore con la PDE5 e la ritenzione dell’inibitore nel VSMC.

In termini più semplici,56, 57 VSMC può essere considerato simile a sacchetti di dialisi contenenti inibitori sia non legati che legati alla PDE5. Man mano che l’inibitore del plasma diminuisce, ci si aspetta che l’inibitore libero nel citosol della cellula diminuisca in parallelo. Tuttavia, la popolazione di molecole inibitrici legate in un complesso inibitore PDE5 può diminuire più lentamente (Figure 4c e 5) perché la fuga dell’inibitore dalla cellula non dipende esclusivamente dalla velocità di diffusione di quella molecola attraverso la membrana al plasma. Piuttosto, le molecole PDE5 possono interferire significativamente con l’uscita dell’inibitore. Gli inibitori sono reversibilmente legati alla PDE5 in modo che il complesso si trovi in un equilibrio dinamico, cioè l’inibitore si dissocia costantemente dall’enzima ad una certa velocità (koff) ed è in rimbalzo ad una certa velocità (kon) (Figura 5). Il rapporto tra koff e kon (chiamato KD) riflette l’affinità dell’enzima per l’inibitore. Con gli inibitori ad alta affinità, l’associazione con PDE5 è favorita in questo equilibrio in modo che gran parte dell’inibitore si ribella rapidamente dopo che si dissocia dall’enzima. L’alta concentrazione di PDE5 favorirebbe anche il rebinding dell’inibitore perché la velocità di legame dell’inibitore è influenzata dalla concentrazione sia dell’inibitore che della PDE5.

Poiché una parte dell’inibitore sfugge alla cellula e viene rimossa dalle vicinanze della cellula dalla circolazione, ci sarebbero siti catalitici PDE5 “aperti” in modo che non solo il rebinding dell’inibitore avvenga con la stessa PDE5, ma anche altre molecole PDE5 sarebbero disponibili per intercettare e legare l’inibitore (Figura 5), impedendo così ulteriormente la fuga dalla cellula. Di conseguenza, una molecola dell’inibitore avrebbe una probabilità molto più alta di rebinding ai siti liberi su PDE5 che di lasciare la cellula. Tale scenario di dissociazione e ri-associazione del farmaco per PDE5 potrebbe potenzialmente verificarsi molte volte prima che si raggiunga la clearance del farmaco dal citosol. Ciò potrebbe comportare la concentrazione e la ritenzione, o “intrappolamento”, del farmaco in VSMC, prolungando così la sua durata d’azione.

L’effetto di questi processi di rallentare il t½ di efflusso inibitore da VSMC può essere quantificato considerando la concentrazione di PDE5 nelle cellule insieme con l’affinità di PDE5 per l’inibitore. L’effetto della PDE5 per rallentare l’uscita dell’inibitore dalla cellula sarebbe proporzionale a 1 + P / KD, dove P è la concentrazione dei siti di legame dell’inibitore sulla PDE5 (concentrazione della subunità PDE5) e KD è la costante di dissociazione di equilibrio del complesso dell’inibitore PDE5.56 Supponendo che PDE5 sia 5 5 × 10-7 M in VSMC8 (dati non pubblicati) e che KD di PDE5 non fosforilato per il vardenafil sia 4 × 10-10 M,12 il legame intracellulare dell’inibitore con PDE5 diminuirebbe il tasso di efflusso di questo inibitore di un fattore di∼1500 rispetto al tasso di efflusso nelle cellule senza PDE5. Questo fattore sarebbe > 1500 se l’affinità del sito catalitico della PDE5 per gli inibitori come il vardenafil è aumentata da eventi cellulari come il legame del cGMP ai siti allosterici della PDE5, la fosforilazione della PDE5, l’esposizione prolungata della proteina all’inibitore o altri processi.

Mentre la PDE5 ha un’affinità intrinsecamente elevata per sildenafil, vardenafil e tadalafil, è stato dimostrato che le modificazioni della proteina aumentano ulteriormente l’affinità per alcuni o tutti questi inibitori, creando un legame ad altissima affinità (Figura 6); questi includono il legame del cGMP con i siti allosterici e catalitici della PDE5, la fosforilazione dell’enzima da parte del PKG, facilitata dal legame dell’inibitore con il sito catalitico della PDE5 o dal legame del cGMP con i siti allosterici della PDE5, l’esposizione dell’enzima all’inibitore per diverse ore o una combinazione di questi effetti.9, 11, 12, 13, 35, 55 Perché cGMP vincolante per allosterico cGMP-i siti di legame della PDE5 e PKG è anche favorita in queste circostanze e protetto contro i guasti,58, 59 il sequestro di cGMP in questi siti si traduce in una maggiore concentrazione cellulare di cGMP rispetto allo stato basale e potrebbe fornire un serbatoio di cGMP per il successivo rilascio, alterando in tal modo l’efficienza derivata da un successivo piccolo aumento nel secondo messaggero segnale.60