mecanismos Moleculares que poderiam contribuir para prolongar a eficácia dos inibidores da PDE5 para melhorar a função erétil

Por todas as contas, a eficácia da ação do sildenafil, vardenafil ou tadalafil para melhorar a resposta erétil aparece para comparar bem. O tempo (Tmax) necessário para atingir a concentração plasmática máxima (Cmax) e o tempo de início da ação variam ligeiramente, com o tadalafil sendo ligeiramente mais lento do que o sildenafil ou o vardenafil. No entanto, os medicamentos diferem substancialmente na taxa de depuração do plasma; t½ de depuração plasmática é ∼4 h para sildenafil ou vardenafil em comparação com 18 h para tadalafil. O efeito do sildenafil ou vardenafil nos homens é ótimo em ∼0,5-1 h, o que se aproxima do tempo de pico da concentração plasmática (Cmax). A concentração plasmática dessas drogas diminui com t½ de ∼4-5 h, de modo que o nível plasmático do fármaco seria baixo após 12 h (∼13% da Cmax). No entanto, estudos indicam que os homens ainda facilitaram as ereções 12 h após a dosagem.20, 30, 31 da mesma forma, os pacientes que tomaram tadalafil, que tem um t½ de ∼18 h, relataram melhora da função erétil em 36 h, quando a concentração plasmática do medicamento seria ∼25% de Cmax.17 a eficácia prolongada destes medicamentos adiciona flexibilidade ao início da atividade sexual para pacientes com DE e pode reduzir a frequência de dosagem. Se esse padrão se aplicar a outros tecidos (por exemplo, a vasculatura pulmonar), isso pode significar que regimes de dosagem menos frequentes podem ser usados para atingir o objetivo terapêutico desejado. Isso pode resultar em menor exposição do paciente à medicação e economia de custos para a terapia.

acredita-se que o curso de tempo da ação do medicamento se correlacione intimamente com o nível plasmático do medicamento. De acordo com este modelo, a eliminação de uma droga do plasma, a saída da droga do tecido e a cessação da ação da droga nesse tecido coincidiriam essencialmente. No entanto, a ação prolongada de inibidores potentes da PDE5 não se encaixa bem neste modelo. Vários mecanismos bioquímicos podem explicar o efeito aparentemente prolongado dos inibidores da PDE5. (1) Se o inibidor for eliminado do tecido em paralelo com a sua depuração do plasma, a persistência dos seus efeitos biológicos deve ser devida à exposição prévia do tecido ao inibidor, talvez em combinação com a ativação persistente da via de sinalização cGMP durante o tempo de exposição (isto é, “memória” celular da experiência de sinalização cGMP). Além disso, se a droga foi eliminada da célula, a atividade PDE5 seria restaurada e o nível de cGMP seria previsto para estar próximo do nível basal (figura 2a). (2) Alternativamente, se a droga não é limpo em paralelo com a autorização do plasma, que é, droga é mantido (ou seqüestrado) em VSMC do corpo cavernoso e degradação de gmpc pelo PDE5 permanece em grande parte bloqueado (Figura 2b), um nível baixo de outras cGMP-hydrolyzing Edps presente nessas células pode reduzir a cGMP um pouco. Isso promoveria (1) ligação sustentada do cGMP aos locais de ligação do cGMP alostérico no PDE5 para aumentar a afinidade pelos inibidores, (2) Ligação sustentada do cGMP ao PKG e ativação da via de sinalização do cGMP e (3) aumento do cGMP celular que não é prontamente hidrolisado. Neste último cenário, as concentrações celulares de inibidor de PDE5 e cGMP seriam elevadas até certo ponto, o que resultaria do sequestro específico de cada um desses ligantes, ou seja, inibidor ligado firmemente ao local catalítico de PDE5 e cGMP ligado firmemente aos locais de ligação de cGMP alostéricos em PKG e PDE5. Essas possíveis explicações para os efeitos prolongados dos inibidores da PDE5 na resposta erétil serão consideradas aqui. Essas hipóteses são baseadas em mecanismos moleculares estabelecidos conhecidos por estarem associados a PDE5 e PKG, embora as considerações não excluam outros mecanismos.

consequências persistentes da ativação da via de sinalização cGMP

a possibilidade de um efeito de “memória” após a exposição do tecido aos inibidores da PDE5 com ou sem elevação concomitante do cGMP será considerada primeiro. Normalmente, a elevação do cGMP e a ativação do PKG colocam em movimento uma cascata de eventos Celulares, e a ação do PDE5 neutraliza esse efeito hidrolisando o nucleotídeo. Em tecidos que foram estudados, evidências sugerem que a ação do PDEs é responsável pela maior parte da capacidade da célula de reduzir os níveis de nucleotídeos cíclicos.32, 33 a presença de inibidores da PDE5 bloqueia a ação da PDE5 e aumenta o acúmulo de cGMP e a sinalização do cGMP. Não se sabe se o nível de cGMP alcançado na presença de inibidores da PDE5 é semelhante ao que ocorre em condições fisiológicas ou se o cGMP se acumula a um nível muito mais alto. Nos músculos lisos da artéria coronária suína, uma elevação tríplice do cGMP produz relaxamento máximo.34 PDE5 é o principal PDE GMP-hidrolisante no corpo cavernoso8, de modo que, enquanto os inibidores da PDE5 estiverem presentes, é provável que um nível significativo de GMPC persista nesse tecido mesmo após a ereção ter diminuído devido a outras influências. Nesse caso, o PKG provavelmente permanecerá ativado até certo ponto por várias horas.

a longa duração do aumento da ação do PKG descrito acima poderia provocar efeitos não experimentados na maioria das circunstâncias fisiológicas, uma vez que a ação do PDE5 na ausência de inibidores seria prevista para retornar rapidamente o cGMP e a atividade do PKG ao nível basal próximo. Acredita-se que os efeitos das reações de fosforilação mediadas por PKG sejam rapidamente contrabalançados pela ação das fosfatases da fosfoproteína. Mesmo em face do declínio da cGMP e diminuição PKG atividade, a reversão dos efeitos do PKG phosphorylations pode diferir entre os phosphoproteins; alguns podem ser rapidamente dephosphorylated e retornou ao seu original estado funcional, outros podem ser protegidos contra rápida dephosphorylation, por sua localização na célula ou por ser complexado com outras proteínas, mantendo assim o efeito original do aumento do cGMP. De fato, pouco se sabe sobre as verdadeiras conseqüências e os cursos de tempo da ação de qualquer um desses caminhos. Se a ativação de PKG e / ou os efeitos das fosforilações mediadas por PKG não forem totalmente revertidos em tempo hábil (figura 2a), a elevação subsequente do cGMP por estímulos eróticos pode produzir uma resposta erétil aumentada mesmo na ausência de inibidores de PDE5. Um efeito prolongado de fosforilação eventos no celular função da proteína pode ocorrer por uma série de mecanismos, incluindo (1) prolongada fosforilação de proteínas alvo na célula, talvez, devido ao lento dephosphorylation por phosphoprotein fosfatases, (2) alterações estruturais, tais como a conversão entre formas que têm diferentes níveis de atividade, (3) alterações nos níveis de proteína, devido à alteração na expressão de genes, de mRNA tradução e/ou estabilidade, e/ou proteína taxa de rotatividade, (4) a translocação de proteínas entre compartimentos celulares e (5) aumento da sensibilidade à cGMP e/ou o via de sinalização cGMP. A fosforilação mediada por PKG de PDE5 produz uma aparente mudança conformacional na enzima e aumenta a afinidade pelo cGMP em seus locais alostéricos e por inibidores/cGMP em seu local catalítico.11, 35, 36, 37 pkg Cíclico ativado por GMP sofre autofosforilação, o que eleva ligeiramente a atividade da enzima mesmo na ausência de cGMP e aumenta sua sensibilidade a aumentos subsequentes no cGMP (Figura 3).38, 39, 40, 41 Autophosphorylation também causa uma aparente alteração conformacional na enzima e promove maior afinidade para o cGMP ligação comparado com unphospho-PKG, retendo, assim, o cGMP no alostéricos cGMP-sítios de ligação;38, 42 desde o cGMP-ligação alostéricos sites de PKG são positivamente cooperativa,43 isso tende a ‘prime’ PKG para ativação completa pela subseqüente pequeno aumento do cGMP. Algumas proteínas que foram fosforiladas por PKG podem subsequentemente ser modificadas covalentemente por outras modificações pós-translacionais, como oxidação, ubiquitinação ou fosforilação por outras quinases que poderiam prolongar ou afetar as conseqüências da sinalização cGMP.

mudanças no nível de proteínas que são substratos para PKG podem ocorrer por vários processos. A fosforilação mediada por PKG tem como alvo fatores de transcrição que regulam a expressão gênica,44, 45 que podem alterar os níveis de proteínas a jusante de PKG. Em outros casos, a fosforilação pode direcionar proteínas para degradação através da via de ubiquitinação.46, 47 a ativação cíclica de GMP de PKG em algumas células provoca a translocação da enzima do citosol para locais subcelulares específicos e fosforilação de proteínas-alvo dentro desse compartimento.44, 45, 48, 49, 50 a ativação de PKG também demonstrou provocar redistribuição de certas proteínas, por exemplo,RhoA, 51 dentro da célula ou inserção de proteínas nas membranas, alterando assim a função.52, 53 alguns processos celulares afetados pela atividade de PKG, por exemplo, alterações na polimerização de proteínas fibrilares ou inserção de proteínas nas membranas podem ser lentas para reverter. Estas são considerações importantes ao aplicar regimes farmacológicos que promovem a elevação do cGMP e que podem ser sustentados por várias horas ou mesmo dias se o indivíduo for medicado cronicamente. As consequências de mudanças de curto prazo na atividade da via de sinalização cGMP podem diferir significativamente da de uma ativação mais sustentada e justificar uma investigação cuidadosa.

a retenção de inibidores da PDE5 no VSMC após a depuração do plasma

a possibilidade de que os inibidores da PDE5 possam ser retidos no VSMC e promover uma melhor resposta erétil mesmo depois de serem eliminados do plasma também é plausível (figuras 2b e 4). Sildenafil, vardenafil e tadalafil não são metabolizados no VSMC; para a reversão do efeito desses medicamentos no tecido, os medicamentos devem se dissociar da PDE5, difundir-se através do citosol até a membrana plasmática, atravessar a membrana plasmática e ser transportados para o fígado para modificação e depuração pela ação dos citocromos. Drogas como essas que têm meias-vidas plasmáticas relativamente curtas, ligam-se com alta afinidade a receptores intracelulares como PDE5, mas não são degradadas na célula-alvo, estão em uma classe um tanto única que não foi estudada extensivamente. Características farmacocinéticas celulares imprevistas que afetam a depuração celular podem se aplicar a esses medicamentos.

espera-se que a entrada e o acúmulo de inibidores da PDE5 nas células sejam impactados pelo nível de PDE5. Consequentemente, prevê–se que as células que são abundantes em PDE5 adquiram e retenham seletivamente o inibidor em comparação com células com pouco ou nenhum PDE5 (figuras 4A-c). Após a absorção dos medicamentos na corrente sanguínea, o inibidor é transportado para a superfície do VSMC pela circulação sistêmica. Inicialmente, a ausência do fármaco no citosol cria um grande gradiente químico para o composto entre o exterior e o interior da célula; isso facilitaria a entrada do fármaco na célula (figura 4a). Como os inibidores estão ligados com afinidade muito alta à PDE5, prevê-se que, assim que um inibidor entrar na célula, ele será quase instantaneamente ligado à PDE5, ou seja, em grande parte sequestrado do citosol, e o inibidor livre no citosol permanecerá muito baixo, mantendo assim o gradiente. A ligação do inibidor à PDE5 aumentará a taxa de acumulação de inibidores, uma vez que, após o influxo do inibidor nas células, o efluxo do inibidor celular deve ser retardado devido à baixa quantidade de inibidor livre no citosol (figura 4a). Além disso, uma porção significativa das moléculas inibidoras que se dissociam da PDE5 provavelmente se reencontraria para a enzima antes de deixar a célula. Esses fatores facilitariam o acúmulo de inibidor na célula proporcional ao nível celular de PDE5. De acordo com este modelo, o acúmulo de inibidor na célula seria saturável e determinado pela concentração de PDE5 intracelular. Quando todas as PDE5 sítios catalíticos são preenchidos (saturada), a concentração de livre inibidor no citosol eventualmente abordagem que no plasma (Figura 4b), mas o total inibidor na célula seria significativamente afetada pelo nível de PDE5 em que a célula, de modo que o total de inibidor na célula=inibidor vinculado a PDE5+grátis inibidor no citosol. A ação prolongada dos inibidores PDE5 comercializados relatados em alguns pacientes também é prevista para resultar dos mesmos processos, ou seja, os efeitos combinados de (1) alto nível de PDE5 em VSMC e (2) alta afinidade de PDE5 para esses inibidores. Basal afinidade de PDE5 para os inibidores, que é intrinsecamente alta (KD=0.1–4 nM), pode aumentar ainda mais, em resposta à elevação da cGMP, como poderia ocorrer com sexuais stimulation12 e/ou exposição prolongada aos respectivos medicamentos.54 conforme discutido abaixo, essa afinidade aumentada é causada pela ligação alostérica do cGMP à PDE5, aumento da fosforilação da enzima e perturbação prolongada do local catalítico da enzima por cGMP elevado e inibidor.9, 11, 12, 55, Portanto, poucas horas após a ingestão de um inibidor de PDE5 ou na presença ou ausência de estímulo sexual, plasma inibidor de concentração seria alto e a previsão é de que o catalisador site da PDE5 em VSMC seria saturada com inibidor e que a afinidade de PDE5 para o inibidor seria significativamente maior do que no estado basal (Figura 4b). Esta ligação de afinidade mais alta promoveria a associação continuada do inibidor com PDE5 e a retenção do inibidor no VSMC.

em termos mais simples, 56, 57 VSMC podem ser considerados semelhantes a Sacos de diálise contendo inibidores não ligados e ligados à PDE5. À medida que o inibidor do plasma diminui, espera-se que o inibidor livre no citosol da célula diminua em paralelo. No entanto, a população de moléculas de inibidor, confeccionada em PDE5-inibidor do complexo pode recusar-se mais lentamente (Figuras 4c e 5) porque fugir do inibidor da célula não é exclusivamente dependente da taxa de difusão da molécula através da membrana para o plasma. Em vez disso, as moléculas de PDE5 podem interferir significativamente na saída do inibidor. Os inibidores estão reversivelmente ligados à PDE5, de modo que o complexo está em um equilíbrio dinâmico, ou seja, o inibidor está constantemente se dissociando da enzima a uma determinada taxa (koff) e sendo rebote a uma certa taxa (kon) (Figura 5). A proporção de koff para kon (chamada KD) reflete a afinidade da enzima pelo inibidor. Com inibidores de alta afinidade, a associação com PDE5 é favorecida nesse equilíbrio, de modo que grande parte dos inibidores se rebindam rapidamente após se dissociar da enzima. A alta concentração de PDE5 também promoveria o rebinding do inibidor porque a taxa de ligação do inibidor é afetada pela concentração de inibidor e PDE5.

Como alguns dos inibidor escapa a célula e é removido da vizinhança da célula, a circulação, não seria ‘abrir’ PDE5 sítios catalíticos de modo a não só religação do inibidor ocorrer com o mesmo PDE5, mas também outros PDE5 moléculas estariam disponíveis para interceptar e vincular o inibidor (Figura 5) e, assim, mais que impedem escapar da cela. Portanto, uma molécula inibidora teria uma probabilidade muito maior de rebinding para locais livres em PDE5 do que de deixar a célula. Tal cenário de dissociação e re-associação do medicamento para PDE5 poderia ocorrer muitas vezes antes que a depuração do medicamento do citosol fosse alcançada. Isso pode resultar em concentração e retenção, ou “aprisionamento”, da droga no VSMC, estendendo assim sua duração de ação.

o efeito desses processos para retardar o t½ de efluxo inibidor de VSMC pode ser quantificado considerando a concentração de PDE5 nas células, juntamente com a afinidade de PDE5 para o inibidor. O efeito da PDE5 para retardar a saída do inibidor da célula seria proporcional a 1 + P / KD, onde P é a concentração de locais de ligação a inibidores na PDE5 (concentração de subunidade PDE5) e KD é a constante de dissociação de equilíbrio do complexo inibidor de PDE5.56 partindo do princípio de que a PDE5 é ∼5 × 10-7 M em VSMC8 (dados não publicados) e que KD unphosphorylated PDE5 para vardenafil é 4 × 10-10 M,de 12 intracelular ligação do inibidor de PDE5, diminuiria a taxa de efluxo deste inibidor por um fator de∼1500 em relação à taxa de efluxo em celas sem PDE5. Este fator seria > 1500 se a afinidade do local catalítico PDE5 para inibidores como o vardenafil é aumentada por eventos celulares, como ligação do cGMP aos locais alostéricos PDE5, fosforilação de PDE5, exposição prolongada da proteína ao inibidor ou outros processos.

embora a PDE5 tenha uma afinidade intrinsecamente alta pelo sildenafil, vardenafil e tadalafil, as modificações da proteína demonstraram aumentar ainda mais a afinidade por alguns ou todos esses inibidores, criando uma ligação de afinidade muito alta (Figura 6); estes incluem a ligação do cGMP aos locais alostéricos PDE5 e ao local catalítico, a fosforilação da enzima por PKG, que é facilitada pela ligação do inibidor ao local catalítico PDE5 ou pela ligação do cGMP aos locais alostéricos no PDE5, a exposição da enzima ao inibidor por várias horas ou uma combinação desses efeitos.9, 11, 12, 13, 35, 55 Porque cGMP ligação para alostéricos cGMP-sítios de ligação no PDE5 e o PKG é também promovida, sob essas circunstâncias, e protegidos contra a discriminação,58, 59 o sequestro de cGMP nestes sites, o resultado seria superior celular concentração de gmpc comparado com o basal estado e podem fornecer um reservatório de cGMP para liberação posterior, alterando assim a eficiência derivada a partir de um subseqüente aumento pequeno no segundo mensageiro sinal.60