moleculaire mechanismen die zouden kunnen bijdragen tot verlengde effectiviteit van PDE5-remmers ter verbetering van de erectiele functie

volgens alle gegevens lijkt de werkzaamheid van sildenafil, vardenafil of tadalafil ter verbetering van de erectiele respons goed te vergelijken. De tijd (Tmax) die nodig is om de maximale plasmaconcentratie (Cmax) te bereiken en het tijdstip van aanvang van de werking variëren licht naarmate tadalafil iets langzamer is dan sildenafil of vardenafil. De geneesmiddelen verschillen echter aanzienlijk in de snelheid van klaring uit het plasma; t½ van de plasmaklaring is ∼4 uur voor sildenafil of vardenafil vergeleken met 18 uur voor tadalafil. Het Effect van sildenafil of vardenafil bij mannen is optimaal bij ∼0,5–1 uur, wat het tijdstip van de piekplasmaconcentratie (Cmax) benadert. De plasmaconcentratie van deze geneesmiddelen neemt af met een t½ van ∼4-5 uur, zodat de plasmaconcentratie na 12 uur laag zou zijn (∼13% van de Cmax). Studies tonen echter aan dat mannen 12 uur na toediening nog steeds erecties hebben gefaciliteerd.20, 30, 31 evenzo hebben patiënten die tadalafil hebben gebruikt, met een t½ van ∼18 uur, een verbeterde erectiele functie bij 36 uur gemeld wanneer de plasmaconcentratie van het geneesmiddel ∼25% van de Cmax zou zijn.De langdurige effectiviteit van deze geneesmiddelen voegt flexibiliteit toe aan het starten van seksuele activiteit voor patiënten met ED en kan de frequentie van dosering verminderen. Als dit patroon van toepassing is op andere weefsels (bijvoorbeeld de pulmonale vasculatuur), kan dit betekenen dat minder frequente doseringsschema ‘ s gebruikt kunnen worden om het gewenste therapeutische doel te bereiken. Dit kan resulteren in een lagere blootstelling van de patiënt aan medicatie en kostenbesparingen voor de therapie.Over het algemeen wordt aangenomen dat het tijdsverloop van de werking van het geneesmiddel nauw samenhangt met de plasmaspiegel van het geneesmiddel. Volgens dit model zou de klaring van een geneesmiddel uit het plasma, de uitgang van het geneesmiddel uit het weefsel en de stopzetting van de werking van het geneesmiddel in dat weefsel in wezen samenvallen. Langdurige werking van krachtige PDE5-remmers past echter niet goed bij dit model. Verschillende biochemische mechanismen kunnen het schijnbaar langdurige effect van PDE5-remmers verklaren. (1) als de remmer parallel met zijn klaring uit plasma uit weefsel wordt gewist, moet de persistentie van zijn biologische effecten te wijten zijn aan eerdere blootstelling van het weefsel aan remmer, misschien in combinatie met persistente activering van de cGMP-signalerende route tijdens de blootstelling (dat wil zeggen, cellulair ‘geheugen’ van de cGMP-signalerende ervaring). Bovendien, als het geneesmiddel uit de cel is geklaard, zou de PDE5-activiteit worden hersteld en zou het cGMP-niveau naar verwachting in de buurt van het basale niveau zijn (figuur 2a). (2) alternatief, als het geneesmiddel niet parallel met de klaring uit plasma wordt geklaard, dat wil zeggen, geneesmiddel wordt behouden (of afgezonderd) in VSMC van het corpus cavernosum en afbraak van cGMP door PDE5 blijft grotendeels geblokkeerd (figuur 2b), kan een laag niveau van andere cGMP-hydrolyserende PDEs aanwezig in deze cellen cGMP enigszins verlagen. Dit zou (1) aanhoudende cGMP-binding aan allosterische cGMP-bindingsplaatsen op PDE5 bevorderen om de affiniteit voor inhibitors te verbeteren, (2) aanhoudende cGMP-binding aan PKG en activering van de cGMP-signalerende route en (3) verhoogde cellulaire cGMP die niet gemakkelijk gehydrolyseerd wordt. In dit laatste scenario zouden de cellulaire concentraties van PDE5-inhibitor en cGMP tot op zekere hoogte worden verhoogd, wat het gevolg zou zijn van specifieke sequestratie van elk van deze liganden, dat wil zeggen, inhibitor die strak aan de katalytische plaats van PDE5 wordt gebonden en cGMP die strak aan allosteric cGMP-bindende plaatsen in PKG en PDE5 wordt gebonden. Deze mogelijke verklaringen voor langdurige effecten van PDE5-remmers op de erectiele respons zullen hierin worden overwogen. Deze hypothesen zijn gebaseerd op gevestigde moleculaire mechanismen waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met PDE5 en PKG, hoewel de overwegingen andere mechanismen niet uitsluiten.

persisterende gevolgen van activering van de cGMP-signaalroute

de mogelijkheid van een ‘geheugen’ – effect na blootstelling van weefsel aan PDE5-remmers met of zonder gelijktijdige verhoging van cGMP zal eerst worden overwogen. Gewoonlijk, zetten de verhoging van cGMP en de activering van PKG in beweging een cascade van cellulaire gebeurtenissen, en de actie van PDE5 tegen dit effect door het nucleotide te hydrolyseren. In weefsels die zijn bestudeerd, stelt het bewijsmateriaal voor dat de actie van PDEs voor het belangrijkste deel van de capaciteit van de cel om cyclische nucleotideniveaus te verminderen verantwoordelijk is.De aanwezigheid van PDE5-remmers blokkeert de werking van PDE5 en verbetert de cGMP-accumulatie en cGMP-signalering. Het is niet bekend of het cGMP-gehalte dat wordt bereikt in aanwezigheid van PDE5-remmers vergelijkbaar is met het cGMP-gehalte dat onder fysiologische omstandigheden wordt bereikt, of dat cGMP zich tot een veel hoger niveau accumuleert. In porcine coronary artery gladde spieren, een drievoudige verhoging van cGMP produceert maximale ontspanning.PDE5 is de belangrijkste cGMP-hydrolyserende PDE in corpus cavernosum8, zodat zolang PDE5-remmers aanwezig zijn, een significant cGMP-gehalte waarschijnlijk in dit weefsel aanwezig blijft, zelfs nadat de erectie door andere invloeden is afgenomen. Als dat zo is, zal PKG waarschijnlijk tot op zekere hoogte gedurende enkele uren geactiveerd blijven.

de lange duur van de verhoogde werking van PKG zoals hierboven beschreven, kan effecten veroorzaken die niet onder de meeste fysiologische omstandigheden worden ervaren, aangezien wordt voorspeld dat de werking van PDE5 in afwezigheid van remmers de cGMP en de activiteit van PKG snel zal terugbrengen tot nabij het basale niveau. De effecten van phosphorylation reacties gemedieerd door PKG worden over het algemeen verondersteld om snel worden gecompenseerd door de werking van phosphoprotein phosphatases. Zelfs in het gezicht van dalende cGMP en verminderde Pkg activiteit, kan de omkering van de gevolgen van PKG phosphorylations tussen phosphoproteins verschillen; sommige kunnen snel worden gedefosforyleerd en terug naar hun oorspronkelijke functionele staat, anderen kunnen tegen snelle defosforylation door hun plaats in de cel worden beschermd of door met andere proteã nen te worden gecomplexeerd, waardoor het oorspronkelijke effect van verhoogde cGMP wordt gesteund. In feite, is weinig bekend over de ware gevolgen en tijd cursussen van de actie van een van deze wegen. Indien de activering van PKG en/of effecten van PKG-gemedieerde fosforylaties niet tijdig volledig worden omgekeerd (figuur 2a), kan een latere verhoging van cGMP door erotische stimuli een verhoogde erectiele respons veroorzaken, zelfs in afwezigheid van PDE5-remmers. Een langdurig effect van fosforyleringsgebeurtenissen op de cellulaire eiwitfunctie kan optreden door een aantal mechanismen, waaronder (1) verlengde fosforylering van doeleiwitten in de cel, mogelijk als gevolg van langzame defosforylering door fosfoproteïnefosfatasen, (2) structurele veranderingen zoals conversie tussen vormen met verschillende activiteitsniveaus, (3) veranderingen in eiwitniveaus als gevolg van verandering in genexpressie, mRNA-vertaling en/of stabiliteit, en/of eiwitomzetsnelheid, (4) translocatie van eiwitten tussen cellulaire compartimenten en (5) verhoogde gevoeligheid voor cGMP en/of de cGMP-signaalweg. PKG-gemedieerde fosforylering van PDE5 veroorzaakt een duidelijke conformationele verandering in het enzym en verhoogt de affiniteit voor cGMP op zijn allosterische plaatsen en voor remmers/cGMP op zijn katalytische plaats.11, 35, 36, 37 cyclisch GMP-geactiveerde PKG ondergaat autofosforylering, waardoor de activiteit van het enzym zelfs bij afwezigheid van cGMP enigszins wordt verhoogd en de gevoeligheid voor daaropvolgende verhogingen van cGMP wordt verhoogd (Figuur 3).Autofosforylatie veroorzaakt ook een duidelijke conformationele verandering in het enzym en bevordert een hogere affiniteit voor cGMP-binding in vergelijking met unfosfo-PKG, waardoor cGMP op de allosterische cGMP-bindingsplaatsen behouden blijft;38, 42 aangezien de cGMP-bindende allosterische plaatsen van PKG positief coöperatief zijn,43 zou dit geneigd zijn om PKG voor volledige activering door een daaropvolgende kleine toename van cGMP te ‘primen’. Sommige proteã nen die door PKG phosphorylated zijn kunnen later covalent door andere posttranslational wijzigingen zoals oxidatie, ubiquitination of phosphorylation door andere kinases worden gewijzigd die de gevolgen van cGMP het signaleren konden verlengen of anderszins beà nvloeden.

de veranderingen in het niveau van proteã nen die substraten voor PKG zijn zouden door talrijke processen kunnen voorkomen. PKG-bemiddelde phosphorylation richt transcriptiefactoren die genuitdrukking,44, 45 regelen die niveaus van proteã NEN stroomafwaarts van PKG konden veranderen. In andere gevallen, kan phosphorylation proteã nen voor analyse via de ubiquitinationweg richten.Cyclische GMP-activering van PKG in sommige cellen leidt tot translocatie van het enzym van cytosol naar specifieke subcellulaire locaties en fosforylering van doeleiwitten binnen dat compartiment.44, 45, 48, 49, 50 de activering van PKG heeft ook getoond om herverdeling van bepaalde proteã nen te veroorzaken, bijvoorbeeld RhoA,51 binnen de cel of het inbrengen van proteã nen in membranen die daardoor functie veranderen.52, 53 sommige cellulaire processen die door PKG-activiteit worden beà nvloed, bijvoorbeeld, veranderingen in de polymerisatie van fibrillaire proteã nen of toevoeging van proteã nen in membranen kunnen langzaam zijn om te keren. Dit zijn belangrijke overwegingen bij het toepassen van farmacologische regimes die verhoging van cGMP bevorderen en die gedurende enkele uren of zelfs dagen kunnen worden gehandhaafd als de persoon chronisch wordt gemedicineerd. De gevolgen van kortetermijnveranderingen in de activiteit van de cGMP-signaalweg kunnen aanzienlijk verschillen van die van een meer aanhoudende activering en rechtvaardigen zorgvuldig onderzoek.

retentie van PDE5-remmers in VSMC na klaring uit plasma

de mogelijkheid dat PDE5-remmers in VSMC behouden blijven en een verbeterde erectiele respons bevorderen, zelfs nadat ze uit het plasma zijn geklaard, is ook aannemelijk (figuren 2b en 4). Sildenafil, vardenafil en tadalafil worden niet gemetaboliseerd in de VSMC; voor omkering van het effect van deze medicijnen in weefsel, moeten de drugs van PDE5 scheiden, door cytosol aan het plasmamembraan diffunderen, het plasmamembraan doorlopen en naar de lever voor wijziging en klaring door de actie van cytochromen worden getransporteerd. De Drugs zoals deze die vrij korte plasmahalfwaardetijden hebben, binden met hoge affiniteit aan intracellular receptoren zoals PDE5, maar zijn niet gedegradeerd in de doelcel, zijn in een enigszins unieke klasse die niet uitgebreid is bestudeerd. Onverwachte cellulaire farmacokinetische kenmerken die de cellulaire klaring beïnvloeden, kunnen op deze geneesmiddelen van toepassing zijn.

verwacht wordt dat de opname en accumulatie van PDE5-remmers in cellen wordt beïnvloed door het PDE5-gehalte. Dienovereenkomstig worden cellen die overvloedig in PDE5 zijn voorspeld om selectief de inhibitor te verwerven en te behouden in vergelijking met cellen met weinig of geen PDE5 (figuren 4a–c). Na absorptie van de drugs in de bloedstroom, wordt de inhibitor getransporteerd naar het vsmc-oppervlak door de systemische omloop. Aanvankelijk, leidt de afwezigheid van de drug in cytosol tot een grote chemische gradiënt voor de samenstelling tussen de buitenkant en het binnenland van de cel; dit zou drugingang in de cel vergemakkelijken (figuur 4a). Aangezien de inhibitors met zeer hoge affiniteit aan PDE5 worden gebonden, wordt voorspeld dat zodra een inhibitor de cel binnenkomt, het bijna onmiddellijk door PDE5 zal worden gebonden, dat wil zeggen, grotendeels van cytosol wordt afgezonderd, en vrije inhibitor in cytosol zeer laag zal blijven, waardoor de gradiënt wordt gehandhaafd. Inhibitorbinding aan PDE5 zal de snelheid van accumulatie van inhibitors verhogen aangezien, na de instroom van inhibitors in cellen, de efflux van cellulaire inhibitors zou moeten worden vertraagd wegens de lage hoeveelheid vrije inhibitors in het cytosol (figuur 4a). Voorts zou een significant deel van de inhibitor molecules die van PDE5 scheiden waarschijnlijk aan het enzym alvorens de cel te verlaten opnieuw binden. Deze factoren zouden accumulatie van inhibitor in de cel in verhouding tot cellulaire niveau van PDE5 vergemakkelijken. Volgens dit model, zou de accumulatie van inhibitor in de cel verzadigbaar zijn en door concentratie van intracellular PDE5 worden bepaald. Wanneer alle katalytische PDE5 plaatsen worden gevuld (verzadigd), zou de concentratie van vrije inhibitor in cytosol uiteindelijk dat in plasma benaderen (figuur 4b), maar totale inhibitor in de cel significant door het niveau van PDE5 in die cel worden beïnvloed zodat totale inhibitor in de cel=inhibitor gebonden aan PDE5+vrije inhibitor in cytosol. De langdurige werking van de gecommercialiseerde PDE5-remmers die bij sommige patiënten zijn gemeld, zal naar verwachting ook het gevolg zijn van dezelfde processen, dat wil zeggen de gecombineerde effecten van (1) hoog PDE5-gehalte in VSMC en (2) hoge affiniteit van PDE5 voor deze remmers. De basale affiniteit van PDE5 voor de inhibitors, die intrinsiek hoog is (KD=0,1–4 nM), kan verder toenemen in reactie op verhoging van cGMP zoals zou optreden bij seksuele stimulatie12 en/of langdurige blootstelling aan de respectievelijke geneesmiddelen.Zoals hieronder wordt besproken, wordt deze verhoogde affiniteit veroorzaakt door allosterische binding van cGMP aan PDE5, verhoogde fosforylering van het enzym en langdurige verstoring van de katalytische plaats van het enzym door verhoogde cGMP en remmer.9, 11, 12, 55 daarom zou een paar uur na inname van een PDE5-remmer in aanwezigheid of afwezigheid van seksuele opwinding de plasma-inhibitor-concentratie hoog zijn en wordt voorspeld dat de katalytische plaats van PDE5 in VSMC verzadigd zou zijn met een remmer en dat de affiniteit van PDE5 voor de remmer significant hoger zou zijn dan in de basale toestand (figuur 4b). Deze hogere affiniteitsbinding zou de voortzetting van de associatie van de remmer met PDE5 en de retentie van de remmer in de VSMC bevorderen.

in de eenvoudigste termen kunnen 56 en 57 VSMC worden beschouwd als dialysezakken die zowel ongebonden als PDE5-gebonden remmers bevatten. Naarmate de plasma-inhibitor afneemt, wordt verwacht dat de vrije inhibitor in het cytosol van de cel parallel afneemt. De populatie van inhibitormoleculen die in een PDE5-inhibitor-complex worden gebonden, kan echter langzamer afnemen (figuren 4c en 5) omdat de ontsnapping van de inhibitor uit de cel niet uitsluitend afhankelijk is van de mate van diffusie van dat molecuul via het membraan naar het plasma. Eerder, kunnen de molecules van PDE5 beduidend in inhibitoruitgang interfereren. Inhibitors zijn reversibel gebonden aan PDE5, zodat het complex zich in een dynamisch evenwicht bevindt, dat wil zeggen dat de inhibitor zich constant met een bepaalde snelheid (koff) van het enzym distantieert en met een bepaalde snelheid (kon) rebound is (Figuur 5). De verhouding van koff aan kon (genoemd KD) weerspiegelt de affiniteit van het enzym voor de inhibitor. Met inhibitors met hoge affiniteit, wordt de associatie met PDE5 in dit evenwicht begunstigd zodat veel van de inhibitor snel rebinds nadat het van het enzym dissocieert. De hoge concentratie van PDE5 zou ook de rebinding van de remmer bevorderen omdat de on-rate van inhibitor binding wordt beïnvloed door de concentratie van zowel inhibitor als PDE5.

aangezien een deel van de inhibitor de cel ontsnapt en door de circulatie uit de omgeving van de cel wordt verwijderd, zouden er ‘open’ PDE5-katalytische plaatsen zijn, zodat niet alleen het opnieuw binden van de inhibitor met dezelfde PDE5 zou plaatsvinden, maar ook andere PDE5-moleculen beschikbaar zouden zijn om de inhibitor te onderscheppen en te binden (Figuur 5), waardoor de ontsnapping uit de cel verder zou worden belemmerd. Daarom zou een inhibitormolecule een veel hogere waarschijnlijkheid hebben om aan vrije plaatsen op PDE5 te rebinden dan om de cel te verlaten. Een dergelijk dissociatie – en herassociatiescenario van het medicijn voor PDE5 kan mogelijk vele malen voorkomen voordat klaring van het medicijn uit cytosol wordt bereikt. Dit zou kunnen resulteren in concentratie en behoud, of ‘gevangen’, van het geneesmiddel in VSMC, waardoor de werkingsduur wordt verlengd.

het effect van deze processen om de t½ van inhibitor-efflux van vsmc te vertragen kan worden gekwantificeerd door rekening te houden met de concentratie van PDE5 in cellen samen met de affiniteit van PDE5 voor de inhibitor. Het effect van PDE5 om inhibitor exit uit de cel te vertragen zou evenredig zijn aan 1+P/KD, waarbij P de concentratie van inhibitor-bindingsplaatsen op PDE5 (PDE5 subunit concentratie) is en KD de evenwichtsdisociatieconstante van het PDE5-inhibitor complex is.Ervan uitgaande dat PDE5 ∼5 × 10-7 M is in VSMC8 (niet-gepubliceerde gegevens) en dat KD van niet-gefosforyleerde PDE5 voor vardenafil 4 × 10-10 M is,zou de intracellulaire binding van remmer aan PDE5 de effluxsnelheid van deze remmer met een factor 1500 1500 verlagen in vergelijking met de effluxsnelheid in cellen zonder PDE5. Deze factor zou >1500 zijn indien de affiniteit van de PDE5 katalytische plaats voor remmers zoals vardenafil verhoogd wordt door cellulaire gebeurtenissen zoals binding van cGMP aan de PDE5 allosterische plaatsen, fosforylering van PDE5, langdurige blootstelling van het eiwit aan remmers of andere processen.

hoewel PDE5 een intrinsiek hoge affiniteit heeft voor sildenafil, vardenafil en tadalafil, is aangetoond dat modificaties van het eiwit de affiniteit voor sommige of alle van deze remmers verder versterken, waardoor een zeer hoge affiniteitbinding ontstaat (Figuur 6); deze omvatten cGMP die aan allosteric plaatsen en katalytische plaats PDE5 binden, phosphorylation van het enzym door PKG die wordt vergemakkelijkt door hetzij inhibitor die aan katalytische plaats PDE5 binden of cGMP die aan allosteric plaatsen op PDE5 binden, blootstelling van het enzym aan inhibitor gedurende verscheidene uren of een combinatie van deze gevolgen.9, 11, 12, 13, 35, 55 omdat cGMP-binding aan allosterische cGMP-bindingsplaatsen op PDE5 en PKG onder deze omstandigheden ook wordt bevorderd en beschermd tegen afbraak,58, 59, zou de vastlegging van cGMP op deze locaties resulteren in een hogere cellulaire concentratie van cGMP in vergelijking met de basale toestand en zou een reservoir van cGMP kunnen bieden voor latere vrijgave, waardoor de efficiëntie wordt gewijzigd die wordt afgeleid van een daaropvolgende kleine toename van het tweede messengersignaal.60