molekylära mekanismer som kan bidra till långvarig effektivitet av PDE5-hämmare för att förbättra erektilfunktionen

av alla konton verkar effekten av sildenafil, vardenafil eller tadalafil för att förbättra erektilresponsen jämföra väl. Tiden (Tmax) som krävs för att uppnå maximal plasmakoncentration (Cmax) och tiden för insättande av verkan varierar något med tadalafil som är något långsammare än sildenafil eller vardenafil. Läkemedlen skiljer sig emellertid väsentligt i graden av clearance från plasma; ttuboli av plasmaclearance är 4huboli för sildenafil eller vardenafil jämfört med 18h för tadalafil. Effekten av sildenafil eller vardenafil hos män är optimal vid 0,5-1 h i 0,5-1 h, vilket approximerar tiden för maximal plasmakoncentration (Cmax). Plasmakoncentrationen av dessa läkemedel avtar med t-6-5 timmar av t-Cmax, så att plasmaläkemedelsnivån skulle vara låg efter 12 timmar(13% av Cmax i Cmax). Studier tyder dock på att män fortfarande har underlättat erektioner 12 timmar efter dosering.20, 30, 31 på samma sätt har patienter som har tagit tadalafil, som har en T -tui på 18 timmar, rapporterat förbättrad erektilfunktion vid 36 timmar när plasmakoncentrationen av läkemedlet skulle vara 25% av Cmax.17 den långvariga effekten av dessa läkemedel ökar flexibiliteten vid initiering av sexuell aktivitet för patienter med ED och kan minska doseringsfrekvensen. Om detta mönster gäller för andra vävnader (till exempel lungvaskulaturen) kan det innebära att mindre frekventa doseringsregimer kan användas för att åstadkomma det önskade terapeutiska målet. Detta kan leda till lägre exponering av patienten för medicinering och kostnadsbesparingar för behandlingen.

tidsförloppet för läkemedelsverkan anses i allmänhet nära korrelera med plasmanivån av läkemedlet. Enligt denna modell skulle clearance av ett läkemedel från plasma, utträde av läkemedel från vävnaden och upphörande av läkemedelsverkan i den vävnaden väsentligen sammanfalla. Långvarig verkan av potenta PDE5-hämmare passar emellertid inte denna modell bra. Flera biokemiska mekanismer kan förklara den till synes långvariga effekten av PDE5-hämmare. (1) om hämmaren rensas från vävnad parallellt med dess clearance från plasma, måste beständigheten av dess biologiska effekter bero på tidigare exponering av vävnaden för hämmare, kanske i kombination med ihållande aktivering av cGMP-signalvägen under exponeringstiden (det vill säga cellulärt ’minne’ för cGMP-signaleringsupplevelsen). Dessutom, om läkemedlet har rensats från cellen, skulle PDE5-aktiviteten återställas och cGMP-nivån skulle förutsägas vara nära basal nivå (figur 2a). (2) alternativt, om läkemedel inte rensas parallellt med clearance från plasma, det vill säga läkemedel behålls (eller sekvestreras) i vsmc i corpus cavernosum och nedbrytning av cGMP med PDE5 förblir till stor del blockerad (Figur 2B), en låg nivå av andra cGMP-hydrolyserande PDE som finns i dessa celler kan sänka cGMP något. Detta skulle främja (1) ihållande cGMP-bindning till allosteriska cGMP-bindningsställen på PDE5 för att förbättra affiniteten för hämmare, (2) ihållande cGMP-bindning till PKG och aktivering av cGMP-signalvägen och (3) ökad cellulär cGMP som inte lätt hydrolyseras. I detta senare scenario skulle cellkoncentrationer av PDE5-hämmare och cGMP höjas i viss utsträckning, vilket skulle bero på specifik sekvestrering av var och en av dessa ligander, det vill säga hämmare bunden tätt till det PDE5-katalytiska stället och cGMP bunden tätt till allosteriska cGMP-bindningsställen i PKG och PDE5. Dessa möjliga förklaringar för långvariga effekter av PDE5-hämmare på erektilsvaret kommer att övervägas häri. Dessa hypoteser är baserade på etablerade molekylära mekanismer som är kända för att vara associerade med PDE5 och PKG även om övervägandena inte utesluter andra mekanismer.

ihållande konsekvenser av aktivering av cGMP-signalvägen

möjligheten till en ’minneseffekt’ efter exponering av vävnad för PDE5-hämmare antingen med eller utan samtidig höjning av cGMP kommer först att övervägas. Vanligtvis sätter förhöjning av cGMP och aktivering av PKG igång en kaskad av cellulära händelser, och verkan av PDE5 motverkar denna effekt genom att hydrolysera nukleotiden. I vävnader som har studerats tyder bevis på att PDE: s verkan står för den största delen av cellens kapacitet att minska cykliska nukleotidnivåer.32, 33 närvaron av PDE5-hämmare blockerar verkan av PDE5 och förbättrar cGMP-ackumulering och cGMP-signalering. Det är inte känt om nivån av cGMP som uppnås i närvaro av PDE5-hämmare liknar den som uppträder under fysiologiska förhållanden eller om cGMP ackumuleras till en mycket högre nivå. I släta muskler i svinkransartären ger en trefaldig höjning av cGMP maximal avkoppling.34 PDE5 är den huvudsakliga cGMP-hydrolyserande PDE i corpus cavernosum8 så att så länge som PDE5-hämmare är närvarande, kommer en signifikant cGMP-nivå sannolikt att kvarstå i denna vävnad även efter att erektionen har avtagit på grund av andra influenser. Om så är fallet kommer PKG sannolikt att förbli aktiverat i viss utsträckning i flera timmar.

den långa varaktigheten av den ökade effekten av PKG som beskrivs ovan kan framkalla effekter som inte upplevs under de flesta fysiologiska omständigheter eftersom PDE5-verkan i frånvaro av hämmare skulle förutsägas att snabbt återgå cGMP och aktivitet av PKG till nära basal nivå. Effekterna av fosforyleringsreaktioner medierade av PKG anses i allmänhet snabbt motverkas av verkan av fosfoproteinfosfataser. Även mot bakgrund av minskande cGMP och minskad PKG-aktivitet kan reversering av effekterna av PKG-fosforyleringar skilja sig mellan fosfoproteinerna; vissa kan snabbt defosforyleras och återgå till sitt ursprungliga funktionella tillstånd, andra kan skyddas mot snabb defosforylering genom deras placering i cellen eller genom att komplexas med andra proteiner och därigenom upprätthålla den ursprungliga effekten av ökad cGMP. Faktum är att lite är känt om de verkliga konsekvenserna och tidskurserna för åtgärden av någon av dessa vägar. Om aktivering av PKG och / eller effekter av PKG-medierade fosforyleringar inte är helt omvända i tid (figur 2a), kan efterföljande höjning av cGMP genom erotiska stimuli ge ett ökat erektilt svar även i frånvaro av PDE5-hämmare. En långvarig effekt av fosforyleringshändelser på cellulär proteinfunktion kan uppstå genom ett antal mekanismer inklusive (1) långvarig fosforylering av målproteiner i cellen, kanske på grund av långsam defosforylering av fosfoproteinfosfataser, (2) strukturella förändringar såsom omvandling mellan former som har olika aktivitetsnivåer, (3) förändringar i proteinnivåer på grund av förändring i genuttryck, mRNA-översättning och/eller stabilitet och/eller proteinomsättningshastighet, (4) translokation av proteiner mellan cellulära fack och (5) ökad känslighet för cGMP och/eller proteinomsättningshastighet, ( cGMP-signalväg. PKG-medierad fosforylering av PDE5 ger en uppenbar konformationsförändring i enzymet och ökar affiniteten för cGMP vid dess allosteriska ställen och för hämmare/cGMP vid dess katalytiska ställe.11, 35, 36, 37 cyklisk GMP-aktiverad PKG genomgår autofosforylering, vilket något höjer enzymets aktivitet även i frånvaro av cGMP och ökar dess känslighet för efterföljande ökningar av cGMP (Figur 3).38, 39, 40,41 Autofosforylering orsakar också en uppenbar konformationsförändring i enzymet och främjar högre affinitet för cGMP-bindning jämfört med unfosfo-PKG, varigenom cGMP bibehålls vid de allosteriska cGMP-bindningsställena;38, 42 eftersom de cGMP-bindande allosteriska ställena för PKG är positivt samarbetsvilliga, 43 detta skulle tendera att ’prime’ PKG för full aktivering av en efterföljande liten ökning av cGMP. Vissa proteiner som har fosforylerats av PKG kan därefter kovalent modifieras av andra posttranslationella modifieringar såsom oxidation, ubiquitination eller fosforylering av andra kinaser som kan förlänga eller på annat sätt påverka konsekvenserna av cGMP-signalering.

förändringar i nivån av proteiner som är substrat för PKG kan ske genom många processer. PKG-medierad fosforylering riktar sig mot transkriptionsfaktorer som reglerar genuttryck,44, 45 som kan förändra nivåer av proteiner nedströms PKG. I andra fall kan fosforylering rikta proteiner för nedbrytning via ubiquitineringsvägen.46, 47 cyklisk GMP-aktivering av PKG i vissa celler framkallar translokation av enzymet från cytosolen till specifika subcellulära platser och fosforylering av målproteiner i det facket.44, 45, 48, 49, 50 aktivering av PKG har också visat sig framkalla omfördelning av vissa proteiner, till exempel RhoA,51 i cellen eller införande av proteiner i membran och därigenom förändra funktionen.52, 53 vissa cellulära processer som påverkas av PKG-aktivitet, till exempel förändringar i polymerisationen av fibrillära proteiner eller införande av proteiner i membran kan vara långsamma att vända. Dessa är viktiga överväganden vid tillämpning av farmakologiska regimer som främjar höjning av cGMP och som kan upprätthållas i flera timmar eller till och med dagar om individen är kroniskt medicinerad. Konsekvenserna av kortsiktiga förändringar i aktiviteten hos cGMP-signalvägen kan skilja sig avsevärt från den för en mer långvarig aktivering och motivera noggrann undersökning.

Retention av PDE5-hämmare i VSMC efter clearance från plasma

möjligheten att PDE5-hämmare kan behållas i VSMC och främja förbättrat erektilt svar även efter att de har rensats från plasma är också troligt (figurerna 2b och 4). Sildenafil, vardenafil och tadalafil metaboliseras inte i vsmc; för reversering av effekten av dessa läkemedel i vävnad måste läkemedlen dissociera från PDE5, diffundera genom cytosolen till plasmamembranet, korsa plasmamembranet och transporteras till levern för modifiering och clearance genom verkan av cytokromer. Läkemedel som dessa som har relativt korta plasmahalveringstider, binder med hög affinitet till intracellulära receptorer såsom PDE5, men inte bryts ned i målcellen, är i en något unik klass som inte har studerats omfattande. Oförutsedda cellulära farmakokinetiska egenskaper som påverkar cellclearance kan gälla för dessa läkemedel.

inträde och ackumulering av PDE5-hämmare i celler förväntas påverkas av nivån av PDE5. Följaktligen förutses celler som är rikliga i PDE5 att selektivt förvärva och behålla hämmaren jämfört med celler med liten eller ingen PDE5 (figurerna 4a–c). Efter absorption av läkemedlen i blodflödet transporteras hämmaren till vsmc-ytan genom den systemiska cirkulationen. Initialt skapar frånvaro av läkemedlet i cytosolen en stor kemisk gradient för föreningen mellan cellens yttre och inre; detta skulle underlätta läkemedelsinträde i cellen (figur 4a). Eftersom hämmarna är bundna med mycket hög affinitet till PDE5, förutses det att så snart en hämmare kommer in i cellen, kommer den nästan omedelbart att bindas av PDE5, det vill säga till stor del sekvestrerad från cytosolen, och fri hämmare i cytosolen kommer att förbli mycket låg och därigenom bibehålla gradienten. Inhibitorbindning till PDE5 kommer att öka ackumuleringshastigheten för hämmare eftersom, efter inhibitorinflöde till celler, efflux av cellulär hämmare bör bromsas på grund av den låga mängden fri hämmare i cytosolen (figur 4a). Vidare skulle en betydande del av inhibitormolekylerna som dissocierar från PDE5 sannolikt återbindas till enzymet innan de lämnar cellen. Dessa faktorer skulle underlätta ackumulering av hämmare i cellen i proportion till cellulär nivå av PDE5. Enligt denna modell skulle ackumulering av hämmare i cellen vara mättbar och bestämd genom koncentration av intracellulär PDE5. När alla PDE5-katalytiska ställen är fyllda (mättade) skulle koncentrationen av fri hämmare i cytosolen så småningom närma sig den i plasma (figur 4b), men total hämmare i cellen skulle påverkas signifikant av nivån av PDE5 i den cellen så att total hämmare i cellen=hämmare bunden till PDE5+fri hämmare i cytosolen. Den långvariga effekten av de kommersialiserade PDE5-hämmare som rapporterats hos vissa patienter förutses också bero på samma processer, det vill säga de kombinerade effekterna av (1) hög nivå av PDE5 i VSMC och (2) hög affinitet för PDE5 för dessa hämmare. Den basala affiniteten hos PDE5 för inhibitorerna, som är inneboende hög (KD=0,1–4 nM), kan öka ytterligare som svar på förhöjning av cGMP som skulle uppstå med sexuell stimulering12 och/eller långvarig exponering för respektive läkemedel.54 såsom diskuteras nedan orsakas denna ökade affinitet av allosterisk bindning av cGMP till PDE5, ökad fosforylering av enzymet och långvarig störning av enzymets katalytiska plats av förhöjd cGMP och hämmare.9, 11, 12, 55 därför, några timmar efter intag av en PDE5-hämmare antingen i närvaro eller frånvaro av sexuell upphetsning, skulle plasmainhibitorkoncentrationen vara hög och det förutses att den katalytiska platsen för PDE5 i VSMC skulle vara mättad med hämmare och att affiniteten hos PDE5 för hämmaren skulle vara signifikant högre än i basaltillståndet (figur 4b). Denna högre affinitetsbindning skulle främja fortsatt associering av hämmaren med PDE5 och retention av hämmaren i VSMC.

i enklaste termer kan 56, 57 VSMC anses likna dialyspåsar som innehåller både obundna och PDE5-bundna hämmare. När plasmahämmaren minskar förväntas fri hämmare i cellens cytosol minska parallellt. Emellertid kan populationen av inhibitormolekyler bundna i ett PDE5-inhibitorkomplex minska långsammare (figurerna 4c och 5) eftersom flykt av inhibitorn från cellen inte uteslutande är beroende av diffusionshastigheten för den molekylen genom membranet till plasma. Snarare kan PDE5-molekyler signifikant störa inhibitorutgången. Hämmare är reversibelt bundna till PDE5 så att komplexet befinner sig i en dynamisk jämvikt, det vill säga att hämmaren ständigt dissocierar från enzymet vid en viss hastighet (koff) och är rebound vid en viss hastighet (kon) (Figur 5). Förhållandet mellan koff och kon (kallad KD) återspeglar enzymets affinitet för hämmaren. Med högaffinitetshämmare gynnas associering med PDE5 i denna jämvikt så att mycket av hämmaren återbinds snabbt efter att den har dissocierats från enzymet. Den höga koncentrationen av PDE5 skulle också främja återbindning av inhibitorn eftersom inhibitorbindningshastigheten påverkas av koncentrationen av både inhibitor och PDE5.

eftersom en del av hämmaren flyr från cellen och avlägsnas från cellens närhet genom cirkulationen, skulle det finnas ’öppna’ PDE5-katalytiska platser så att inte bara återbindning av hämmaren skulle ske med samma PDE5, utan också andra PDE5-molekyler skulle vara tillgängliga för att fånga upp och binda hämmaren (Figur 5) och därigenom ytterligare hindra Flykten från cellen. Därför skulle en inhibitormolekyl ha en mycket högre sannolikhet för återbindning till fria platser på PDE5 än att lämna cellen. Ett sådant dissociations-och återassociationsscenario för läkemedlet för PDE5 kan potentiellt inträffa många gånger innan clearance av läkemedlet från cytosolen uppnås. Detta kan resultera i koncentration och retention, eller ’fångst’, av läkemedlet i VSMC, vilket förlänger dess verkningstid.

effekten av dessa processer för att sakta ner t-exporten av inhibitorutflöde från VSMC kan kvantifieras genom att beakta koncentrationen av PDE5 i celler tillsammans med affiniteten hos PDE5 för inhibitorn. Effekten av PDE5 för att bromsa inhibitorutgången från cellen skulle vara proportionell mot 1+P/KD, där P är koncentrationen av inhibitorbindningsställen på PDE5 (PDE5-subenhetskoncentration) och KD är jämviktsdissociationskonstanten för PDE5-inhibitorkomplexet.56 om man antar att PDE5 är 5 10-7 m i vsmc8 (opublicerade data) och att KD för ofosforylerad PDE5 för vardenafil är 4 10-10 m,skulle 12 intracellulära bindningar av inhibitorn till PDE5 minska utflödeshastigheten för denna inhibitor med en faktor 1500 i enlighet med utflödeshastigheten i celler utan PDE5. Denna faktor skulle vara > 1500 om affiniteten hos det PDE5-katalytiska stället för hämmare såsom vardenafil ökas genom cellulära händelser såsom bindning av cGMP till PDE5-allosteriska ställen, fosforylering av PDE5, långvarig exponering av proteinet för hämmare eller andra processer.

medan PDE5 har en inneboende hög affinitet för sildenafil, vardenafil och tadalafil, har modifieringar av proteinet visat sig ytterligare förbättra affiniteten för vissa eller alla av dessa hämmare, vilket skapar mycket hög affinitetsbindning (Figur 6); dessa inkluderar cGMP-bindning till PDE5-allosteriska ställen och katalytiska ställen, fosforylering av enzymet med PKG vilket underlättas av antingen inhibitorbindning till PDE5-katalytiska stället eller cGMP-bindning till allosteriska ställen på PDE5, exponering av enzymet för hämmare i flera timmar eller en kombination av dessa effekter.9, 11, 12, 13, 35, 55 eftersom cGMP-bindning till allosteriska cGMP-bindningsställen på PDE5 och PKG också främjas under dessa omständigheter och skyddas mot nedbrytning,skulle 58, 59 bindningen av cGMP på dessa ställen resultera i högre cellkoncentration av cGMP jämfört med basaltillståndet och kan ge en reservoar av cGMP för efterföljande frisättning, vilket förändrar effektiviteten härledd från en efterföljande liten ökning av den andra budbärarsignalen.60