mecanisme moleculare care ar putea contribui la eficacitatea prelungită a inhibitorilor PDE5 pentru îmbunătățirea funcției erectile

din toate punctele de vedere, eficacitatea acțiunii sildenafilului, vardenafilului sau tadalafilului pentru a spori răspunsul erectil pare să se compare bine. Timpul (Tmax) necesar pentru atingerea concentrației plasmatice maxime (Cmax) și timpul de debut al acțiunii variază ușor, tadalafilul fiind ușor mai lent decât sildenafilul sau vardenafilul. Cu toate acestea, medicamentele diferă substanțial în ceea ce privește rata clearance-ului plasmatic; t-ul plasmatic al clearance-ului plasmatic este de 4 ore pentru sildenafil sau vardenafil, comparativ cu 18 ore pentru tadalafil. Efectul sildenafilului sau vardenafilului la bărbați este optim la 0,5–1 h, care aproximează timpul concentrației plasmatice maxime (Cmax). Concentrația plasmatică a acestor medicamente se diminuează cu T 0XT de 4-5 h, astfel încât nivelul plasmatic al medicamentului să fie scăzut după 12 h (13% din Cmax). Cu toate acestea, studiile indică faptul că bărbații încă au facilitat erecțiile la 12 ore după administrare.20, 30, 31 de asemenea, pacienții care au luat tadalafil, care are un T de la 18 ore, au raportat îmbunătățirea funcției erectile la 36 de ore când concentrația plasmatică a medicamentului ar fi de 25% din Cmax.17 eficacitatea prelungită a acestor medicamente adaugă flexibilitate la inițierea activității sexuale pentru pacienții cu ED și ar putea reduce frecvența dozării. Dacă acest model se aplică altor țesuturi (de exemplu, vasculatura pulmonară), ar putea însemna că regimurile de dozare mai puțin frecvente ar putea fi utilizate pentru a atinge obiectivul terapeutic dorit. Acest lucru ar putea duce la o expunere mai mică a pacientului la medicamente și la economii de costuri pentru terapie.

cursul de timp al acțiunii medicamentului este, în general, considerat a fi strâns corelat cu nivelul plasmatic al medicamentului. Conform acestui model, eliminarea unui medicament din plasmă, ieșirea medicamentului din țesut și încetarea acțiunii medicamentului în acel țesut ar coincide în esență. Cu toate acestea, acțiunea prelungită a inhibitorilor puternici de PDE5 nu se potrivește bine acestui model. Mai multe mecanisme biochimice ar putea explica efectul aparent prelungit al inhibitorilor PDE5. (1) dacă inhibitorul este eliminat din țesut în paralel cu clearance-ul său din plasmă, atunci persistența efectelor sale biologice trebuie să se datoreze expunerii anterioare a țesutului la inhibitor, probabil în combinație cu activarea persistentă a căii de semnalizare cGMP în timpul expunerii (adică memoria celulară a experienței de semnalizare cGMP). Mai mult, dacă medicamentul a fost eliminat din celulă, activitatea PDE5 ar fi restabilită și nivelul cGMP ar fi estimat a fi aproape de nivelul bazal (figura 2a). (2) alternativ, dacă medicamentul nu este eliminat în paralel cu clearance-ul plasmatic, adică medicamentul este reținut (sau sechestrat) în VSMC al corpului cavernos și descompunerea cGMP prin PDE5 rămâne în mare parte blocată (figura 2b), un nivel scăzut al altor PDE hidrolizate cGMP prezente în aceste celule ar putea scădea oarecum cGMP. Aceasta ar favoriza (1) legarea susținută a GMPc de situsurile alosterice de legare a GMPc pe PDE5 pentru a spori afinitatea pentru inhibitori, (2) legarea susținută a GMPc de PKG și activarea căii de semnalizare a GMPc și (3) creșterea GMPc celulară care nu este ușor hidrolizată. În acest ultim scenariu, concentrațiile celulare ale inhibitorului PDE5 și cGMP ar fi crescute într-o oarecare măsură, ceea ce ar rezulta din sechestrarea specifică a fiecăruia dintre acești liganzi, adică inhibitorul legat strâns de situsul catalitic PDE5 și cGMP legat strâns de situsurile de legare alosterice ale cGMP în PKG și PDE5. Aceste explicații posibile pentru efectele prelungite ale inhibitorilor PDE5 asupra răspunsului erectil vor fi luate în considerare aici. Aceste ipoteze se bazează pe mecanisme moleculare stabilite cunoscute a fi asociate cu PDE5 și PKG, deși considerațiile nu exclud alte mecanisme.

consecințe persistente ale activării căii de semnalizare a GMPc

se va lua în considerare mai întâi posibilitatea unui efect de ‘memorie’ după expunerea țesutului la inhibitori ai PDE5, fie cu sau fără creșterea concomitentă a GMPc. În mod obișnuit, creșterea cGMP și activarea PKG pun în mișcare o cascadă de evenimente celulare, iar acțiunea PDE5 contracarează acest efect prin hidrolizarea nucleotidei. În țesuturile care au fost studiate, dovezile sugerează că acțiunea PDE reprezintă cea mai mare parte a capacității celulei de a reduce nivelurile de nucleotide ciclice.32, 33 prezența inhibitorilor PDE5 blochează acțiunea PDE5 și îmbunătățește acumularea cGMP și semnalizarea cGMP. Nu se cunoaște dacă nivelul de GMPc atins în prezența inhibitorilor PDE5 este similar cu cel care apare în condiții fiziologice sau dacă GMPc se acumulează la un nivel mult mai ridicat. În mușchii netezi ai arterei coronare porcine, o creștere triplă a cGMP produce relaxare maximă.34 PDE5 este principalul PDE hidrolizat de cGMP în corpul cavernos8, astfel încât, atâta timp cât inhibitorii PDE5 sunt prezenți, este posibil ca un nivel semnificativ de cGMP să persiste în acest țesut chiar și după ce erecția a scăzut din cauza altor influențe. Dacă da, este posibil ca PKG să rămână activat într-o oarecare măsură timp de câteva ore.

durata lungă a acțiunii crescute a PKG descrisă mai sus ar putea determina efecte care nu au fost experimentate în majoritatea circumstanțelor fiziologice, deoarece acțiunea PDE5 în absența inhibitorilor ar fi prezisă să readucă rapid cGMP și activitatea PKG la un nivel bazal apropiat. În general, se consideră că efectele reacțiilor de fosforilare mediate de PKG sunt contrabalansate rapid de acțiunea fosfoproteinelor fosfataze. Chiar și în fața scăderii GMPc și a scăderii activității PKG, inversarea efectelor FOSFORILĂRILOR PKG poate diferi între fosfoproteine; unele pot fi defosforilate rapid și readuse la starea lor funcțională inițială, altele pot fi protejate împotriva defosforilării rapide prin localizarea lor în celulă sau prin complexarea cu alte proteine, susținând astfel efectul inițial al creșterii GMPc. De fapt, se știe puțin despre adevăratele consecințe și cursuri de timp ale acțiunii oricăreia dintre aceste căi. Dacă activarea PKG și / sau efectele fosforilărilor mediate de PKG nu sunt complet inversate în timp util (figura 2a), creșterea ulterioară a cGMP de către stimulii erotici poate produce un răspuns erectil sporit chiar și în absența inhibitorilor PDE5. Un efect prelungit al evenimentelor de fosforilare asupra funcției proteinelor celulare ar putea apărea printr-o serie de mecanisme, inclusiv (1) fosforilarea prelungită a proteinelor țintă în celulă, probabil datorită defosforilării lente de către fosfoproteine fosfataze, (2) modificări structurale, cum ar fi conversia între forme care au niveluri diferite de activitate, (3) modificări ale nivelurilor de proteine datorate modificării expresiei genelor, translației ARNm și/sau stabilității și/sau ratei de rotație a proteinelor, (4) translocarea proteinelor între compartimentele celulare și (5) sensibilitate crescută la GMPc și/sau cGMP-cale de semnalizare. Fosforilarea mediată de PKG a PDE5 produce o modificare conformațională aparentă a enzimei și crește afinitatea pentru cGMP în situsurile sale alosterice și pentru inhibitori/cGMP în situsul său catalitic.11, 35, 36, 37 PKG activat de GMP ciclic suferă autofosforilare, care crește ușor activitatea enzimei chiar și în absența cGMP și crește sensibilitatea acesteia la creșterile ulterioare ale cGMP (Figura 3).38, 39, 40,41 Autofosforilarea determină, de asemenea, o modificare conformațională aparentă a enzimei și promovează o afinitate mai mare pentru legarea GMPc comparativ cu nefosfo-PKG, menținând astfel GMPc în locurile de legare alosterice ale GMPc;38, 42 deoarece situsurile alosterice de legare ale GMPc sunt pozitiv cooperante, 43 aceasta ar tinde să fie ‘prime’ pentru activarea completă printr-o creștere ulterioară mică a GMPc. Unele proteine care au fost fosforilate de PKG pot fi ulterior modificate covalent prin alte modificări posttranslaționale, cum ar fi oxidarea, ubiquitinarea sau fosforilarea de către alte kinaze care ar putea prelungi sau afecta altfel consecințele semnalizării cGMP.

modificările nivelului de proteine care sunt substraturi pentru PKG ar putea apărea prin numeroase procese. Fosforilarea mediată de PKG vizează factorii de transcripție care reglează expresia genelor,44, 45, care ar putea modifica nivelurile de proteine în aval de PKG. În alte cazuri, fosforilarea poate viza proteinele pentru descompunere prin calea de ubiquitinare.46, 47 activarea GMP ciclică a PKG în unele celule determină translocarea enzimei din citosol în locații subcelulare specifice și fosforilarea proteinelor țintă în acel compartiment.44, 45, 48, 49, 50 activarea PKG s-a dovedit, de asemenea,că provoacă redistribuirea anumitor proteine, de exemplu, RhoA, 51 în interiorul celulei sau inserarea proteinelor în membrane modificând astfel funcția.52, 53 unele procese celulare afectate de activitatea PKG, de exemplu, modificările în polimerizarea proteinelor fibrilare sau inserția proteinelor în membrane pot fi lent inversate. Acestea sunt considerații importante atunci când se aplică regimuri farmacologice care favorizează creșterea GMPc și care pot fi menținute timp de câteva ore sau chiar zile dacă individul este medicamentat cronic. Consecințele schimbărilor pe termen scurt în activitatea căii de semnalizare cGMP pot diferi semnificativ de cea a unei activări mai susținute și necesită o investigație atentă.

retenția inhibitorilor PDE5 în VSMC după clearance-ul plasmatic

posibilitatea ca inhibitorii PDE5 să fie reținuți în VSMC și să promoveze îmbunătățirea răspunsului erectil chiar și după eliminarea lor din plasmă este, de asemenea, plauzibilă (figurile 2b și 4). Sildenafilul, vardenafilul și tadalafilul nu sunt metabolizate în VSMC; pentru inversarea efectului acestor medicamente în țesut, medicamentele trebuie să se disocieze de PDE5, să difuzeze prin citosol la membrana plasmatică, să traverseze membrana plasmatică și să fie transportate la ficat pentru Modificare și clearance prin acțiunea citocromilor. Medicamente precum acestea care au timp de înjumătățire plasmatică relativ scurt, se leagă cu afinitate ridicată de receptorii intracelulari precum PDE5, dar nu sunt degradate în celula țintă, se află într-o clasă oarecum unică care nu a fost studiată pe larg. Caracteristicile farmacocinetice celulare neprevăzute care afectează clearance-ul celular se pot aplica acestor medicamente.

se așteaptă ca intrarea și acumularea inhibitorilor PDE5 în celule să fie afectate de nivelul PDE5. În consecință, se preconizează că celulele care sunt abundente în PDE5 vor dobândi și reține selectiv inhibitorul în comparație cu celulele cu PDE5 puțin sau deloc (figurile 4A–c). După absorbția medicamentelor în fluxul sanguin, inhibitorul este transportat la suprafața VSMC prin circulația sistemică. Inițial, absența medicamentului în citosol creează un gradient chimic mare pentru compusul dintre exteriorul și interiorul celulei; acest lucru ar facilita intrarea medicamentului în celulă (figura 4a). Deoarece inhibitorii sunt legați cu o afinitate foarte mare la PDE5, se preconizează că, de îndată ce un inhibitor intră în celulă, acesta va fi aproape instantaneu legat de PDE5, adică în mare parte sechestrat de citosol, iar inhibitorul liber din citosol va rămâne foarte scăzut, menținând astfel gradientul. Legarea inhibitorilor de PDE5 va crește rata de acumulare a inhibitorilor, deoarece, după influxul inhibitorilor în celule, efluxul inhibitorului celular trebuie încetinit din cauza cantității mici de inhibitor liber din citosol (figura 4a). Mai mult, o parte semnificativă a moleculelor inhibitoare care se disociază de PDE5 s-ar lega probabil de enzimă înainte de a părăsi celula. Acești factori ar facilita acumularea inhibitorului în celulă proporțional cu nivelul celular al PDE5. Conform acestui model, acumularea de inhibitor în celulă ar fi saturabilă și determinată de concentrația de PDE5 intracelular. Când toate situsurile catalitice ale PDE5 sunt umplute (saturate), concentrația inhibitorului liber în citosol s-ar apropia în cele din urmă de cea din plasmă (figura 4b), dar inhibitorul total din celulă ar fi afectat semnificativ de nivelul de PDE5 din acea celulă, astfel încât inhibitorul total din celulă=inhibitor legat de PDE5+inhibitor liber în citosol. Acțiunea prelungită a inhibitorilor PDE5 comercializați raportați la unii pacienți este, de asemenea, prevăzută să rezulte din aceleași procese, adică efectele combinate ale (1) nivel ridicat de PDE5 în VSMC și (2) afinitate ridicată a PDE5 pentru acești inhibitori. Afinitatea bazală a PDE5 pentru inhibitori, care este intrinsec ridicată (KD=0,1–4 nM), poate crește și mai mult ca răspuns la creșterea GMPc, așa cum s-ar întâmpla cu stimularea sexuală12 și/sau expunerea prelungită la medicamentele respective.54 după cum s-a discutat mai jos, această afinitate crescută este cauzată de legarea alosterică a GMPc de PDE5, de fosforilarea crescută a enzimei și de perturbarea prelungită a situsului catalitic al enzimei prin creșterea GMPc și a inhibitorului.9, 11, 12, 55 prin urmare, la câteva ore după ingestia unui inhibitor de PDE5, fie în prezența, fie în absența excitației sexuale, concentrația inhibitorului plasmatic ar fi ridicată și se preconizează că situsul catalitic al PDE5 în VSMC ar fi saturat cu inhibitor și că afinitatea PDE5 pentru inhibitor ar fi semnificativ mai mare decât în starea bazală (figura 4b). Această legare cu afinitate mai mare ar favoriza asocierea continuă a inhibitorului cu PDE5 și reținerea inhibitorului în VSMC.

în termeni simpli,se poate considera că 56, 57 VSMC seamănă cu pungile de dializă care conțin atât inhibitori nelegați, cât și inhibitori legați de PDE5. Pe măsură ce inhibitorul plasmatic scade, este de așteptat ca inhibitorul liber din citosolul celulei să scadă în paralel. Cu toate acestea, populația de molecule inhibitoare legate într-un complex inhibitor PDE5 poate scădea mai lent (figurile 4C și 5), deoarece scăparea inhibitorului din celulă nu depinde exclusiv de viteza de difuzie a moleculei respective prin membrană în plasmă. Mai degrabă, moleculele PDE5 pot interfera semnificativ cu ieșirea inhibitorului. Inhibitorii sunt legați reversibil de PDE5, astfel încât complexul se află într-un echilibru dinamic, adică inhibitorul se disociază constant de enzimă la o anumită rată (koff) și este recul la o anumită rată (kon) (Figura 5). Raportul dintre koff și kon (numit KD) reflectă afinitatea enzimei pentru inhibitor. Cu inhibitori cu afinitate ridicată, asocierea cu PDE5 este favorizată în acest echilibru, astfel încât o mare parte din inhibitor se rebindează rapid după ce se disociază de enzimă. Concentrația mare de PDE5 ar favoriza, de asemenea, rebindarea inhibitorului, deoarece rata de legare a inhibitorului este afectată atât de concentrația inhibitorului, cât și de PDE5.

deoarece o parte din inhibitor scapă din celulă și este îndepărtat din vecinătatea celulei prin circulație, ar exista situri catalitice PDE5 deschise, astfel încât nu numai că ar avea loc rebindarea inhibitorului cu același PDE5, dar și alte molecule PDE5 ar fi disponibile pentru a intercepta și lega inhibitorul (Figura 5), împiedicând astfel evadarea din celulă. Prin urmare, o moleculă inhibitoare ar avea o probabilitate mult mai mare de a se lega de site-urile libere de pe PDE5 decât de a părăsi celula. Un astfel de scenariu de disociere și re-asociere a medicamentului pentru PDE5 ar putea apărea de mai multe ori înainte de eliminarea medicamentului din citosol. Acest lucru ar putea duce la concentrarea și reținerea medicamentului în VSMC, extinzându-i astfel durata de acțiune.

efectul acestor procese de încetinire a t-XIQ al efluxului inhibitor din VSMC poate fi cuantificat luând în considerare concentrația de PDE5 în celule împreună cu afinitatea PDE5 pentru inhibitor. Efectul PDE5 de a încetini ieșirea inhibitorului din celulă ar fi proporțional cu 1+P/KD, unde P este concentrația situsurilor de legare a inhibitorului pe PDE5 (concentrația subunității PDE5) și KD este constanta de disociere de echilibru a complexului inhibitor PDE5.56 presupunând că PDE5 este de la 5 la 10-7 m în VSMC8 (date nepublicate) și că KD de PDE5 nefosforilat pentru vardenafil este de 4 la 10-10 m,12 legarea intracelulară a inhibitorului de PDE5 ar reduce rata de eflux a acestui inhibitor cu un factor de la 1500 la 1500 în comparație cu rata de eflux în celulele fără PDE5. Acest factor ar fi > 1500 dacă afinitatea situsului catalitic al PDE5 pentru inhibitori cum este vardenafilul este crescută prin evenimente celulare cum sunt legarea GMPc de situsurile alosterice ale PDE5, fosforilarea PDE5, expunerea prelungită a proteinei la inhibitor sau alte procese.

în timp ce PDE5 are o afinitate intrinsec mare pentru sildenafil, vardenafil și tadalafil, s-a demonstrat că modificările proteinei sporesc și mai mult afinitatea pentru unii sau pentru toți acești inhibitori, creând o afinitate foarte mare de legare (Figura 6); acestea includ legarea GMPc de situsurile alosterice ale PDE5 și situsul catalitic, fosforilarea enzimei de către PKG, care este facilitată fie de legarea inhibitorilor de situsul catalitic al PDE5, fie de legarea GMPc de situsurile alosterice ale PDE5, expunerea enzimei la inhibitor timp de câteva ore sau o combinație a acestor efecte.9, 11, 12, 13, 35, 55 deoarece legarea cGMP de situsurile de legare alosterice ale cGMP pe PDE5 și PKG este,de asemenea, stimulată în aceste circumstanțe și protejată împotriva descompunerii, 58, 59 sechestrarea cGMP în aceste situsuri ar duce la o concentrație celulară mai mare de cGMP în comparație cu starea bazală și ar putea furniza un rezervor de cGMP pentru eliberarea ulterioară, modificând astfel eficiența derivată dintr-o creștere mică ulterioară a celui de-al doilea semnal messenger.60