molekulární mechanismy, které by mohly přispět k prodloužené účinnosti inhibitorů PDE5 ke zlepšení erektilní funkce

zdá se, že účinnost účinku sildenafilu, vardenafilu nebo tadalafilu ke zvýšení erektilní odpovědi se dobře srovnává. Doba (Tmax) potřebná k dosažení maximální plazmatické koncentrace (Cmax) a doba nástupu účinku se mírně liší, přičemž tadalafil je mírně pomalejší než sildenafil nebo vardenafil. Léky se však podstatně liší rychlostí clearance z plazmy; t½ plazmatické clearance je ∼4 h pro sildenafil nebo vardenafil ve srovnání s 18 h pro tadalafil. Účinek sildenafilu nebo vardenafilu u mužů je optimální při ∼0,5-1 h, což se blíží době vrcholové plazmatické koncentrace (Cmax). Plazmatická koncentrace těchto léků klesá s t½ ∼4-5 h, takže plazmatická hladina léčiva by byla nízká po 12 h (∼13% Cmax). Studie však ukazují, že muži stále mají usnadněnou erekci 12 hodin po podání.20, 30, 31 podobně pacienti, kteří užívali tadalafil, který má t½ ∼18 h, hlásili zlepšení erektilní funkce při 36 hodinách, kdy by plazmatická koncentrace léčiva byla ∼25% Cmax.17 prodloužená účinnost těchto léků zvyšuje flexibilitu při zahájení sexuální aktivity u pacientů s ED a může snížit frekvenci dávkování. Pokud se tento vzorec vztahuje na jiné tkáně (například plicní vaskulaturu), mohlo by to znamenat, že k dosažení požadovaného terapeutického cíle mohou být použity méně časté dávkovací režimy. To by mohlo mít za následek nižší expozici pacienta lékům a úspory nákladů na terapii.

časový průběh účinku léku je obecně považován za úzce korelující s plazmatickou hladinou léčiva. Podle tohoto modelu by se clearance léčiva z plazmy, výstup léčiva z tkáně a zastavení účinku léčiva v této tkáni v podstatě shodovaly. Dlouhodobé působení silných inhibitorů PDE5 se však tomuto modelu nehodí dobře. Zdánlivě prodloužený účinek inhibitorů PDE5 může vysvětlit několik biochemických mechanismů. (1) pokud je inhibitor vylučován z tkáně souběžně s jeho clearance z plazmy, musí být přetrvávání jeho biologických účinků způsobeno předchozí expozicí tkáně inhibitoru, možná v kombinaci s přetrvávající aktivací signální dráhy cGMP během doby expozice(tj. Navíc, pokud by byl léčivý přípravek z buňky vyčištěn, aktivita PDE5 by byla obnovena a hladina cGMP by se předpokládala v blízkosti bazální úrovně (obrázek 2a). (2) alternativně, pokud léčivo není vyčištěno paralelně s clearance z plazmy, to znamená, že léčivo je zadrženo (nebo sekvestrováno) ve vsmc corpus cavernosum a rozpad cGMP PDE5 zůstává do značné míry blokován (obrázek 2b), nízká hladina jiných cGMP-hydrolyzujících PDE přítomných v těchto buňkách by mohla cGMP poněkud snížit. To by podpořilo (1) trvalou vazbu cGMP na alosterická místa vázající cGMP na PDE5 pro zvýšení afinity k inhibitorům, (2) trvalou vazbu cGMP na PKG a aktivaci signální dráhy cGMP a (3) zvýšený buněčný cGMP, který není snadno hydrolyzován. V tomto druhém scénáři by buněčné koncentrace inhibitoru PDE5 a cGMP byly do určité míry zvýšeny, což by bylo výsledkem specifické sekvestrace každého z těchto ligandů, to znamená, inhibitor pevně vázaný na katalytické místo PDE5 a cGMP pevně vázaný na alosterická místa vázající cGMP v PKG a PDE5. Tato možná vysvětlení pro prodloužené účinky inhibitorů PDE5 na erektilní odpověď budou zde zvážena. Tyto hypotézy jsou založeny na zavedených molekulárních mechanismech, o nichž je známo, že jsou spojeny s PDE5 a PKG, i když úvahy nevylučují jiné mechanismy.

přetrvávající důsledky aktivace signální dráhy cGMP

nejprve bude zvážena možnost „paměťového“ účinku po expozici tkáně inhibitorům PDE5 buď se současným zvýšením cGMP nebo bez něj. Obvykle, zvýšení cGMP a aktivace PKG uvede do pohybu kaskádu buněčných událostí, a působení PDE5 tento účinek počítá hydrolyzací nukleotidu. V tkáních, které byly studovány, důkazy naznačují, že působení PDEs představuje hlavní část kapacity buňky ke snížení hladin cyklických nukleotidů.32, 33 přítomnost inhibitorů PDE5 blokuje působení PDE5 a zvyšuje akumulaci cGMP a signalizaci cGMP. Není známo, zda je hladina cGMP dosažená v přítomnosti inhibitorů PDE5 podobná hladině, která se vyskytuje za fyziologických podmínek, nebo pokud se cGMP hromadí na mnohem vyšší úrovni. V prasečích hladkých svalech koronární arterie vytváří trojnásobné zvýšení cGMP maximální relaxaci.34 PDE5 je hlavní cGMP-hydrolyzující PDE v corpus cavernosum8, takže pokud jsou přítomny inhibitory PDE5, je pravděpodobné, že významná hladina cGMP přetrvává v této tkáni i poté, co erekce ustoupila v důsledku jiných vlivů. Pokud ano, PKG pravděpodobně zůstane aktivován do určité míry několik hodin.

dlouhé trvání zvýšeného účinku pkg popsaného výše by mohlo vyvolat účinky, které se za většiny fyziologických okolností nezaznamenaly, protože by se předpokládalo, že účinek PDE5 v nepřítomnosti inhibitorů rychle vrátí cGMP a aktivitu PKG na téměř bazální úroveň. Obecně se předpokládá, že účinky fosforylačních reakcí zprostředkovaných PKG jsou rychle vyváženy působením fosfoproteinových fosfatáz. I při poklesu cGMP a snížené aktivitě PKG se může zvrácení účinků pkg fosforylací mezi fosfoproteiny lišit; některé mohou být rychle defosforylovány a vráceny do původního funkčního stavu, jiné mohou být chráněny proti rychlé defosforylaci jejich umístěním v buňce nebo komplexováním s jinými proteiny, čímž se udržuje původní účinek zvýšeného cGMP. Ve skutečnosti je málo známo o skutečných důsledcích a časových průbězích působení jedné z těchto cest. Pokud aktivace pkg a/nebo účinky fosforylací zprostředkovaných PKG nejsou včas plně zvráceny (obrázek 2a), následné zvýšení cGMP erotickými podněty může vyvolat zvýšenou erektilní odpověď i v nepřítomnosti inhibitorů PDE5. K prodlouženému účinku fosforylačních příhod na funkci buněčných proteinů může dojít řadou mechanismů, včetně (1) prodloužené fosforylace cílových proteinů v buňce, možná v důsledku pomalé defosforylace fosfoproteinovými fosfatázami, (2) strukturálních změn, jako je konverze mezi formami, které mají různé úrovně aktivity, (3) změn hladin proteinů v důsledku změny genové exprese, translace mRNA a/nebo stability a/nebo rychlosti obratu proteinů, (4) translokace proteinů mezi buněčnými kompartmenty a (5) zvýšená citlivost na cGMP a/nebo proteinové fosfatázy. cGMP-signální dráha. Fosforylace PDE5 zprostředkovaná PKG vyvolává zjevnou konformační změnu enzymu a zvyšuje afinitu k cGMP v jeho alosterických místech a k inhibitorům / cGMP v jeho katalytickém místě.11, 35, 36, 37 cyklický GMP aktivovaný PKG podléhá autofosforylaci, což mírně zvyšuje aktivitu enzymu i v nepřítomnosti cGMP a zvyšuje jeho citlivost na následné zvýšení cGMP (obrázek 3).38, 39, 40, 41 Autofosforylace také způsobuje zjevnou konformační změnu enzymu a podporuje vyšší afinitu k vazbě cGMP ve srovnání s unfosfo-PKG, čímž udržuje cGMP na alosterických místech vázajících cGMP; 38, 42 protože alosterická místa vázající cGMP pkg jsou pozitivně kooperativní, 43 To by mělo tendenci „prime“ PKG pro úplnou aktivaci následným malým zvýšením cGMP. Některé proteiny, které byly fosforylovány PKG, mohou být následně kovalentně modifikovány jinými posttranslačními modifikacemi, jako je oxidace, ubikvitinace nebo fosforylace jinými kinázami, které by mohly prodloužit nebo jinak ovlivnit důsledky signalizace cGMP.

změny v hladině proteinů, které jsou substráty pro PKG, mohou nastat mnoha procesy. Fosforylace zprostředkovaná PKG se zaměřuje na transkripční faktory, které regulují genovou expresi, 44, 45, které by mohly změnit hladiny proteinů za PKG. V jiných případech může fosforylace cílit na proteiny pro rozklad prostřednictvím ubikvitinační dráhy.46, 47 cyklická GMP aktivace PKG v některých buňkách vyvolává translokaci enzymu z cytosolu do specifických subcelulárních míst a fosforylaci cílových proteinů v tomto kompartmentu.44, 45, 48, 49, 50 bylo také prokázáno, že aktivace PKG vyvolává redistribuci určitých proteinů, například RhoA,51 uvnitř buňky nebo vložení proteinů do membrán, čímž mění funkci.52, 53 některé buněčné procesy ovlivněné aktivitou PKG, například změny polymerace fibrilárních proteinů nebo vložení proteinů do membrán, mohou být pomalé zvrátit. To jsou důležité úvahy při aplikaci farmakologických režimů, které podporují zvýšení cGMP a které mohou být udržovány po dobu několika hodin nebo dokonce dnů, pokud je jedinec chronicky léčen. Důsledky krátkodobých změn v aktivitě signální dráhy cGMP se mohou výrazně lišit od důsledků trvalejší aktivace a vyžadují pečlivé vyšetřování.

retence inhibitorů PDE5 ve VSMC po clearance z plazmy

možnost, že inhibitory PDE5 mohou být zachovány ve VSMC a podporují zlepšenou erektilní odpověď i po jejich odstranění z plazmy, je také věrohodná (obrázky 2b a 4). Sildenafil, vardenafil a tadalafil nejsou metabolizovány ve VSMC; pro zvrácení účinku těchto léků v tkáni musí léky disociovat od PDE5, difundovat cytosolem do plazmatické membrány, procházet plazmatickou membránou a být transportovány do jater pro modifikaci a clearance působením cytochromů. Léky, jako jsou tyto, které mají relativně krátké plazmatické poločasy, se vážou s vysokou afinitou k intracelulárním receptorům, jako je PDE5, ale nejsou degradovány v cílové buňce, jsou v poněkud jedinečné třídě, která nebyla rozsáhle studována. Na tyto léky se mohou vztahovat neočekávané buněčné Farmakokinetické vlastnosti, které ovlivňují buněčnou clearance.

očekává se, že vstup a akumulace inhibitorů PDE5 v buňkách budou ovlivněny hladinou PDE5. V souladu s tím se předpokládá, že buňky, které jsou bohaté na PDE5, selektivně získávají a udržují inhibitor ve srovnání s buňkami s malým nebo žádným PDE5 (obrázky 4a-c). Po absorpci léčiv do krevního oběhu je inhibitor transportován na povrch VSMC systémovou cirkulací. Zpočátku nepřítomnost léčiva v cytosolu vytváří velký chemický gradient pro sloučeninu mezi vnějším a vnitřním prostorem buňky; to by usnadnilo vstup léčiva do buňky (obrázek 4a). Vzhledem k tomu, že inhibitory jsou vázány s velmi vysokou afinitou k PDE5, předpokládá se, že jakmile inhibitor vstoupí do buňky, bude téměř okamžitě vázán PDE5, tj. Vazba inhibitorů na PDE5 zvýší rychlost akumulace inhibitorů, protože po přílivu inhibitorů do buněk by měl být eflux buněčného inhibitoru zpomalen kvůli nízkému množství volného inhibitoru v cytosolu (obrázek 4a). Kromě toho by významná část molekul inhibitoru, které se disociují z PDE5, pravděpodobně rebindovala na enzym před opuštěním buňky. Tyto faktory by usnadnily akumulaci inhibitoru v buňce odpovídající buněčné hladině PDE5. Podle tohoto modelu by akumulace inhibitoru v buňce byla saturovatelná a určena koncentrací intracelulárního PDE5. Když jsou všechna katalytická místa PDE5 naplněna (nasycena), koncentrace volného inhibitoru v cytosolu by se nakonec přiblížila koncentraci v plazmě (obrázek 4b), ale celkový inhibitor v buňce by byl významně ovlivněn hladinou PDE5 v této buňce, takže celkový inhibitor v buňce=inhibitor vázaný na PDE5+Volný inhibitor v cytosolu. Předpokládá se, že prodloužený účinek komercializovaných inhibitorů PDE5 hlášených u některých pacientů bude také důsledkem stejných procesů, to znamená kombinovaných účinků (1) vysoké hladiny PDE5 ve VSMC a (2) vysoké afinity PDE5 pro tyto inhibitory. Bazální afinita PDE5 k inhibitorům, která je vnitřně vysoká (KD=0,1-4 nM), se může dále zvyšovat v reakci na zvýšení cGMP, jak by se vyskytlo při sexuální stimulaci12 a/nebo dlouhodobé expozici příslušným lékům.54 jak je uvedeno níže, tato zvýšená afinita je způsobena alosterickou vazbou cGMP na PDE5, zvýšenou fosforylací enzymu a prodlouženou perturbací katalytického místa enzymu zvýšeným cGMP a inhibitorem.9, 11, 12, 55 proto by několik hodin po požití inhibitoru PDE5 buď v přítomnosti nebo nepřítomnosti sexuálního vzrušení byla koncentrace inhibitoru v plazmě vysoká a předpokládá se, že katalytické místo PDE5 ve VSMC by bylo nasyceno inhibitorem a že afinita PDE5 k inhibitoru by byla významně vyšší než v bazálním stavu (obrázek 4b). Tato vazba s vyšší afinitou by podpořila pokračující asociaci inhibitoru s PDE5 a retenci inhibitoru ve VSMC.

zjednodušeně lze 56, 57 VSMC považovat za podobné dialyzačním vakům obsahujícím jak nevázané, tak inhibitory vázané na PDE5. Vzhledem k tomu, že inhibitor plazmy klesá, lze očekávat, že volný inhibitor v cytosolu buňky bude klesat paralelně. Populace molekul inhibitoru vázaných v komplexu inhibitorů PDE5 však může klesat pomaleji (obrázky 4c a 5), protože únik inhibitoru z buňky není výlučně závislý na rychlosti difúze této molekuly přes membránu do plazmy. Molekuly PDE5 mohou významně interferovat s výstupem inhibitoru. Inhibitory jsou reverzibilně vázány na PDE5, takže komplex je v dynamické rovnováze, to znamená, že inhibitor se neustále disociuje od enzymu určitou rychlostí (koff) a je odrazen určitou rychlostí (kon) (obrázek 5). Poměr koff ke kon (nazývaný KD) odráží afinitu enzymu k inhibitoru. U inhibitorů s vysokou afinitou je v této rovnováze upřednostňována asociace s PDE5, takže velká část inhibitoru se po disociaci z enzymu rychle rebinduje. Vysoká koncentrace PDE5 by také podpořila rebinding inhibitoru, protože rychlost vazby inhibitoru je ovlivněna koncentrací inhibitoru i PDE5.

vzhledem k tomu, že některé inhibitory unikají z buňky a jsou cirkulací odstraněny z blízkosti buňky, existovala by „otevřená“ katalytická místa PDE5, takže by nejen došlo k opětovnému navázání inhibitoru se stejným PDE5, ale také by byly k dispozici další molekuly PDE5 pro zachycení a vazbu inhibitoru (obrázek 5), čímž by se dále bránilo úniku z buňky. Proto by molekula inhibitoru měla mnohem vyšší pravděpodobnost opětovného navázání na volná místa na PDE5 než opuštění buňky. Takový disociační a re-asociační scénář léčiva pro PDE5 by se mohl potenciálně objevit mnohokrát před dosažením clearance léčiva z cytosolu. To by mohlo mít za následek koncentraci a zadržení nebo „zachycení“ léčiva ve VSMC, čímž se prodlouží jeho trvání účinku.

účinek těchto procesů na zpomalení t½ efluxu inhibitoru z VSMC lze kvantifikovat zvážením koncentrace PDE5 v buňkách spolu s afinitou PDE5 k inhibitoru. Účinek PDE5 na pomalý výstup inhibitoru z buňky by byl úměrný 1 + P / KD, kde P je koncentrace vazebných míst inhibitoru na PDE5 (koncentrace podjednotky PDE5) a KD je rovnovážná disociační konstanta komplexu inhibitoru PDE5.56 za předpokladu, že PDE5 je ∼5 × 10-7 M ve VSMC8 (nepublikovaná data) a že KD nefosforylovaného PDE5 pro vardenafil je 4 × 10-10 M, 12 intracelulární vazba inhibitoru na PDE5 by snížila rychlost efluxu tohoto inhibitoru o faktor 1500 1500 ve srovnání s rychlostí efluxu v buňkách bez PDE5. Tento faktor by byl >1500, pokud by afinita katalytického místa PDE5 k inhibitorům, jako je vardenafil, byla zvýšena buněčnými jevy, jako je vazba cGMP na alosterická místa PDE5, fosforylace PDE5, prodloužená expozice proteinu inhibitorům nebo jiným procesům.

zatímco PDE5 má vnitřní vysokou afinitu k sildenafilu, vardenafilu a tadalafilu, bylo prokázáno, že modifikace proteinu dále zvyšují afinitu k některým nebo všem těmto inhibitorům, což vytváří velmi vysokou afinitní vazbu (obrázek 6); patří mezi ně vazba cGMP na alosterická místa PDE5 a katalytické místo, fosforylace enzymu PKG, která je usnadněna buď vazbou inhibitoru na katalytické místo PDE5, nebo vazbou cGMP na alosterická místa na PDE5, expozicí enzymu inhibitoru po dobu několika hodin nebo kombinací těchto účinků.9, 11, 12, 13, 35, 55 protože vazba cGMP na alosterická místa vázající cGMP na PDE5 a PKG je za těchto okolností také podporována a chráněna před rozpadem, 58, 59 sekvestrace cGMP v těchto místech by vedla k vyšší buněčné koncentraci cGMP ve srovnání s bazálním stavem a mohla by poskytnout rezervoár cGMP pro následné uvolnění, čímž by se změnila účinnost odvozená z následného malého zvýšení druhého messengerového signálu.60